Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00
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Esta investigación fue apoyada [en parte] por el programa de investigación intramuros del NIH, Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental. Agradecimiento especial a Shyamal Peddada para el análisis estadístico. También queremos agradecer a Humphrey Yao, Gary Ave y Yuki Arao para la revisión de este manuscrito y Franco DeMayo por su continuo apoyo y asesoramiento.

Todas las operaciones se realizaron como parte del funcionamiento normal de la instalación de NIEHS Knock Out Mouse base. Todos los ratones fueron mantenidos en un 12:12 ciclo de h luz: oscuridad y se alimentan una dieta de agua y NIH-31 ad libitum. Todos los experimentos fueron realizados según el cuidado Animal y Comité de uso del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental.
1. animal preparación
<ol><li>Raza de ratones donantes, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos/j ...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Durante mucho tiempo se ha pensado que cualquier disturbio del ICM podría conducir a la mortalidad, de hecho, los protocolos actuales de microinyección blastocisto todavía advierten de esta12,13. Lo que hemos mostrado aquí es la microinyección a través de la RIC no es perjudicial para el embrión y aumenta la producción de quimeras.
El mecanismo exacto de este efecto no ha sido identificado. Sin embargo, la interrupción mecáni...

Durante casi 25 años, la creación de ratones genéticamente apuntados ha sido un proceso lento, a menudo obstaculizado por un cuello de botella en la etapa de blastocistos ES células microinyección para la generación de germline transmisión de quimeras. Los avances recientes, incluyendo CRISPR/Cas91,2 en células madre embrionarias y de alto rendimiento ES célula consorcios de generación como KOMP, han mejorado la generación y disponibilidad de modificados genéticamente células madre embrionarias. Sin embargo, la generación de quimeras del germline sigue siendo un cuello de botella en la creación de ratones modificados genéticamente de estas células ES3,4. Proyectos de generación de alto rendimiento ES la célula han estado plagados de alta variabilidad en la calidad de células ES, que es crítica para la exitosa creación de quimeras del germline. Además, algunas de las líneas de células ES comúnmente utilizadas son conocidos por aneuploidia alta y la difícil producción de germline quimeras competentes5.
Muchos métodos se han desarrollado para la creación de ratones con una quimera o superior, o totalmente celular ES derivado ratones6,7,8,9,10. Mientras que cada uno de estos sistemas tiene sus propios méritos, también tienen sus defectos. La generación de quimeras tetraploides, mientras que la generación de celulares ES de 100% derivados de ratones, es ineficiente y generalmente limitado a líneas exogámica 5,6. Más nuevos métodos de inyección de mórula pueden producir alto porcentaje quimeras, cercana al 100%, pero generalmente requieren equipo adicional significativa (láser o piezoeléctricos) y capacitación10,11. En laboratorios donde estas técnicas ya están en marcha, esta nueva metodología puede no ser necesaria.
Objetivo de este estudio fue encontrar un método que utiliza técnicas comunes y equipos disponibles para aumentar la velocidad de generación de quimera, aumentando la posibilidad de transmisión del germline del alelo del mutante para establecer la colonia de ratón posterior.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

En un esfuerzo por aumentar la eficiencia en la creación de ratones modificados genéticamente a través de metodologías ES celular, presentamos una adaptación del protocolo actual de inyección de blastocisto. Aquí divulgamos que una simple rotación del embrión y de la inyección a través de la masa celular de Trans-interno (TICM) aumentó el porcentaje de ratones quiméricos del 31% al 50%, con ningún equipo adicional o formación más especializada. endogámicas de 26 diferentes clones y clones total 35 fueron inyectados en un período de 9 meses. No hubo diferencias significativas en la tasa de embarazo o índice de recuperación de embriones entre técnicas de inyección tradicional y TICM. Por lo tanto, sin ninguna alteración importante en el proceso de inyección y un simple posicionamiento del blastocisto e inyectar a través del ICM, liberación de las células madre embrionarias en la cavidad del blastocoel puede mejorar potencialmente la cantidad de producción quimérica y posterior transmisión de la línea germinal.

Tratamiento de la línea celular como el efecto aleatorio, un modelo lineal de efectos mixtos se utilizó para analizar los datos en el software (e.g. SAS (versión 9.2)). Cada análisis para el número de embriones transferidos y la línea celular. El segundo análisis también controlado por el número de cachorros que sobrevivieron.
Para este estudio, cada línea ES celular y el clon fue inyectado con tradicionales y técnica...

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

The overall goal of this modified procedure is to increase chimeric production without incurring additional costs or long training periods. This method can help laboratories become more efficient in chimera production, especially in cases where the ES cells are less than optimal. The main advantage of this technique is that it requires no additional equipment and no specialized training.Demonstrating the procedure today will be Thomas Hagler. He's a biologist and graduate student who works in the core lab. To harvest the embryos, blot the uterus on a lab tissue to remove the excess blood and place the organ in a new 60 millimeter dish under a low magnification dissecting microscope.Using dissecting forceps to carefully and gently hold the uterus near the oviduct, insert a 25 gauge needle attached to a 10 milliliter syringe containing 10 milliliters of blast collection medium into the center of the uterus just beyond the tips of the forceps in as parallel a plane as possible. Apply pressure to the forceps to secure the needle within the uterus and gently flush approximately one milliliter of medium through the uterine horn. When all of the blastocysts have been expelled, assemble the mouth pipette apparatus and use the mouth pipette to transfer the individual embryos into single drops of blast collection medium in a second 60 millimeter dish.Then wash each embryo in a second drop of blast collection medium and transfer the embryos into a four-well dish until their injection. To begin, use a microinjector to apply vacuum to the injection needle. Place a dish of ES cells under the injection microscope where the injection needle and embryo holder pipette are attached.It is essential to the success of the injection to take the time to properly setup the microscope. This includes the proper amount of media in the needle and the correct alignment of the z-axis. Use a microinjector to apply vacuum to the injection needle.Keeping as little space between the cells as possible, draw in smoothly surfaced small to medium sized embryonic cells without obvious defects from the dish of embryos. After collecting at least 15 cells, position an embryo near the opening of the holder. Apply vacuum to secure the embryo to the holder and move the holding pipette up or down to adjust the z-axis until the embryo is just touching the slide.Fine focus on the zone of pellucida and adjust the z-axis of the injection needle until the embryonic cells near the tip of the needle are in focus. If needed, use the injection needle to gently roll the blastocyst until the inner cell mass is in the appropriate position for injection. Using a firm but controlled push, insert the injection needle through the zone of pellucida into the inner cell mass and apply a slight pressure to the microinjector of the injection needle to help keep the blastocoele from collapsing.Once the needle has penetrated the blastocoele, apply pressure to the microinjector to transfer all of the embryonic stem cells into embryo, pausing briefly as the bevel of the needle starts to exit the embryo to allow the pressure in the embryo to return to normal while still retaining the cells. When all of the blastocysts have been injected, use a nonsurgical embryo transfer device to deliver the embryos to embryonic stage 2.5 Swiss Webster mice according to the manufacturer's instructions and house the mice individually after each transfer through delivery and subsequent weaning. In this representative experiment, the pregnancy rates were unaltered between the trans inner cell mass injected and control traditionally injected groups and an equal number of pups survived to weaning from each group.Notably, while the number of mice at weaning remained unchanged, a significantly higher number of pups from the trans inner cell mass injected group displayed coat-color chimerism compared to the control injected group. The best part of this technique is that it only requires a simple change in the orientation of the embryo to facilitate greater production in chimeras. Proper setup of the microscope is essential.If the microscope and manipulators aren't setup properly and maintained well, the injection process will not work. If you're new to embryo injections, repetition is the only way to learn. For beginners, embryo handling tends to be the most difficult part of the procedure.Being able to move embryos efficiently from one dish to another without losing any is the most crucial part of the experiment. After watching this video, you should have a good understanding of how a simple change to your standard injection technique can help you become more efficient in chimera production.

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Investigación

Biología

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Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

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the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia Miembro Posterior

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

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El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

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