Name: an integrated platform for genome-wide mapping of chromatin states using high-throughput chip-sequencing in tumor tissues
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues at JoVE.com

Nous remercions Marcus Coyle, Curtis Gumbs, noyau SMF au MDACC pour le soutien de séquençage. Le travail décrit dans cet article a été soutenu par des subventions de la subvention du NIH (CA016672) à base de SMF et NCI récompenses (1K99CA160578 et R00CA160578) K. R.

Tous les échantillons cliniques ont été obtenues en suivant les directives de l’Institutional Review Board.
1. préparation de la mémoire tampon
<ol><li>Faire 200 mL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 10 mM tétraacétique (EDTA) l’acide pH 8.0).</li>
	<li>Faire 200 mL de tampon STE (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).</li>
	<li>Faire 200 mL de 2,0 M glycine (g 37,52 de glycine dans 200 mL d’eau) et chauffer à 65 ° C.</li>
	<li>Faire 200 mL de solution à 5 % sodium Déso...

<ol>
	<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulated+Neighborhoods:+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control.">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMARCB1-mediated+SWI/SNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation.">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li><li>J&#228;ger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci.">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178 (2015).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element.">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking.">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li><li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+malfunction+in+cancer.">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification.">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+epigenomes.">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li><li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes.">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors.">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033 (2014).</li><li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity.">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086 (2014).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium.">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li><li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes.">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li><li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromHMM:+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization.">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li><li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS.">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q2ChIP,+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay,+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells.">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development.">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li><li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition.">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1,000+mouse+early+embryonic+cells.">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li><li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method,+Matrix+ChIP:+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events.">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+chromatin+immunoprecipitation+assay.">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).</li><li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data.">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Tang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pyflow-ChIPseq:+a+snakemake+based+ChIP-seq+pipeline.">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li><li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine.">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis.">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li><li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data.">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).</li><li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression.">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans.">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression.">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li><li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing.">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li><li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles.">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li></ol>

Ce protocole décrit un module complet et détaillé de ChIP-seq haut débit pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les lignées de cellules et tissus tumoraux humains. Dans n’importe quel protocole de ChIP-seq, une des étapes plus importantes est la spécificité de l’anticorps. Ici, cette méthode illustre l’immunoprécipitation des conditions pour les décrit six modifications d’histone, qui sont de qualité ChIP et ont été déjà validés dans notre et d’autres laboratoires<sup ...

La majorité des génomes de mammifères (98-99 %) est constituée de séquences non codantes, et ces régions nocoding contiennent des éléments régulateurs connus pour participer au contrôle de l’expression des gènes et la chromatine organisation1,2. Dans une cellule normale, l’assembly spécifique de l’ADN génomique dans la structure de la chromatine compactée est critique pour l’organisation spatiale, le règlement et le calendrier précis de divers processus liés à l’ADN3,4,5. Dans une cellule cancéreuse Toutefois, des modifications de la chromatine par des mécanismes épigénétiques aberrants peuvent conduire à une mauvaise organisation de la structure de la chromatine, notamment l’accès aux éléments de régulation, systèmes de bouclage chromosomiques et gene expression patterns6, 7,8,9,10.
Malgré des progrès récents, nous avons limité la compréhension des altérations épigénétiques qui sont associés à la progression tumorale ou de la réponse thérapeutique. L’épigénome consiste en un tableau des modifications, y compris les marques histone et la méthylation de l’ADN, qui composent un état dynamique (dénommé État de la chromatine) qui empiète sur les réseaux de l’expression génique et autres processus essentiels pour le maintien identité cellulaire. Récemment, altérations de rehausseurs ont été présentées dans plusieurs tumeurs malignes en étudiant H3K27Ac profils11. Bien que ces études permettent de mieux comprendre la corrélation entre les marques épigénétiques isolés, plus de 100 modifications épigénétiques ont été identifiés12,,13 , sans une compréhension claire de leurs rôles biologiques et interdépendance. En outre, il y a un nombre encore plus grand des modèles combinatoires possibles de ces histones et les modifications de l’ADN, et c’est ces modèles combinatoires - modifications non individuels - qui dictent les États épigénétiques14. Par conséquent, il y a un besoin énorme d’identifier les altérations dans ces États de la chromatine au cours de la progression du cancer ou des réponses à la thérapie. Connaissance approfondie de l’épigénome altérations dans les cancers a été en retard en partie en raison de la technique (par exemple la génération de données à grande échelle de petite quantité de cellules cliniques de matériel/single) et analytique (par exemple des algorithmes pour définir défis de combinatoire d’États). Par conséquent, il est besoin critique de Méthodes robustes de haut-débit pour profiler le grand nombre de marques modification histone de matériel clinique et easy-to-implement approches informatiques pour prédire la combinatoire qui facilitera détermination des États épigénétiques associé à différentes étapes de la tumorigenèse et de résistance thérapeutique. Données supplémentaires, de récentes épigénome profilage études15,16,17,18,19,20,21, 22,23 dans les tissus normaux et les lignées cellulaires peuvent être intégrées aux profils de la chromatine des tumeurs pour plus amples aperçus épigénome contribution à la biologie de la tumeur.
Profilage de la chromatine est devenu un puissant outil pour identifier les profils de liaison globale des divers chromatine modifications15,24. Ces dernières années, ChIP-seq est devenu le « gold standard » pour l’étude des interactions ADN-protéines sur une échelle mondiale25,26,27. Pour toute expérience de ChIP-seq, il y a des étapes critiques nécessaires à son succès, y compris la dissociation et le traitement de tissus, de constatation dans des conditions optimales sonication, déterminer la concentration en anticorps optimal pour les précipitations, préparation de la bibliothèque, traitement des données après séquençage et analyse en aval. Chacune de ces étapes contiennent des points de contrôle clés contrôle de la qualité et ensemble, sont indispensable pour bien identifier les cibles potentielles pour la validation fonctionnelle. Grâce à l’innovation dans ces étapes, plusieurs études antérieures ont élaboré des méthodes pour effectuer une puce ou un ChIP-Seq de petite quantité de tissus28,29,30,31,32 . De plus, certaines études ont suggéré des protocoles pour les expériences de puce haut débit suivies par PCR basée quantification33,34. Enfin, certaines plates-formes d’analyse disponibles publiquement pour ChIP-Seq données sont maintenant disponibles comme Easeq35 et36de la galaxie. Cependant, une plate-forme intégrée pour effectuer des ChIP-Seq dans un mode haut-débit en combinaison avec un pipeline calcul pour effectuer la marque unique ainsi que des analyses d’état de la chromatine a fait défaut.
Ce protocole décrit un workflow de ChIP-seq complète et global pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les tissus de la tumeur et de lignées cellulaires, avec facile à suivre les lignes directrices qui englobe toutes les étapes nécessaires pour une expérience réussie. En adoptant une méthode de haut débit, déjà décrite par Blecher-Gonen et al. 37, ce protocole peut être effectué sur des dizaines d’échantillons en parallèle et a été appliqué avec succès sur des lignées de cellules cancéreuses et tumeurs humaines telles que le mélanome, côlon, prostate et glioblastome multiforme. Nous démontrons la méthodologie pour six modifications d’histone de base qui représentent des composantes clés du paysage réglementaire épigénétique dans les lignées de cellules de mélanome humain et des échantillons de tumeur. Ces modifications incluent H3K27ac (exhausteurs), H3K4me1 (exhausteurs actives et posés), H3K4me3 (promoteurs), H3K79me2 (transcrit les régions), H3K27me3 (polycomb répression) et H3K9me3 (hétérochromatique répression). Ces marques utilisable seul ou en combinaison pour identifier des États de chromatine fonctionnellement distinctes représentant les domaines répressifs et actives.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K4me1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K27ac antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K4me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K79me2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K27me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K9me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris HCl, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma - Life Sciences</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TWEEN-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - IgG-free</td>
			<td>Sigma - Life Sciences</td>
			<td>A2058-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibo</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C tube</td>
			<td>GentleMACS</td>
			<td>120-008-466</td>
			<td>disassociation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde</td>
			<td>Peierce</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniProtease inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>protease inhibitor tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10009D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor NGS tubes 0.65 mL</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C30010011</td>
			<td>sonication tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag - 96 Side Skirted</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120.27</td>
			<td>96-well magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100005393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>paramagnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7645L</td>
			<td>DNA Library Prep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7335L</td>
			<td>Multiplex Oligos&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7500L</td>
			<td>Multiplex Oligos&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 4200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>high sensitivity DNA electropherogram instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico sonication device&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td>water bath disruputor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer</td>
			<td>Nutator</td>
			<td>421105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet</td>
			<td>Denville</td>
			<td>1003123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Skirted Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>47744-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-12R Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99464</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620461</td>
			<td>tabletop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strips (8x Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8x strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Tips, 10 Pk</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA MS3 vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated platform for genome-wide mapping of chromatin states using high-throughput chip-sequencing in tumor tissues

Histone modifications constituent une composante majeure de l’épigénome et jouent un rôle réglementaire important dans la détermination de l’État transcriptionnel de loci associés. En outre, la présence de modifications spécifiques a été utilisée pour déterminer la position et l’identité non codantes des éléments fonctionnels comme améliorateurs. Ces dernières années, immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage de la génération suivant (ChIP-seq) est devenu un outil puissant pour déterminer les profils de génome des modifications des histones individuelles. Cependant, il est devenu plus en plus évident que les modèles combinatoires de modifications de la chromatine, appelées États de chromatine, déterminent l’identité et la nature du locus génomique associé. Par conséquent, les workflows consistant en des méthodologies (HT) haut débit robustes pour le profilage d’un certain nombre de marques de modification des histones, mais aussi des pipelines d’analyses informatiques capables de manipulation des myriades de ChIP-Seq profilage datasets, sont nécessaires pour détermination complète des États épigénomique en grand nombre d’échantillons. Le HT-ChIP-Seq workflow présenté ici se compose de deux modules : 1) un protocole expérimental pour le profilage de plusieurs modifications d’histone de petites quantités d’échantillons de tumeurs et de lignées cellulaires dans un format 96 puits ; et 2) un pipeline d’analyse de données informatiques qui combine des outils existants pour calculer les modèles d’état de la chromatine combinatoires et les occupation marque individuelle. Ensemble, ces deux modules de facilitent le traitement facile des centaines d’échantillons de ChIP-Seq de manière rapide et efficace. Le flux de travail présentée ici est utilisée pour dériver des modèles d’état de la chromatine de 6 profils de marque histone dans les tumeurs de mélanome et de lignées cellulaires. Dans l’ensemble, nous présentons un workflow de ChIP-seq complète qui peut être appliqué à des dizaines d’échantillons de tumeurs humaines et des lignées de cellules cancéreuses pour déterminer épigénomique aberrations dans diverses tumeurs malignes.

Ce protocole permet l’immunoprécipitation de tissus tumoraux congelés et des lignées de cellules qui peuvent être effectuées sur des dizaines d’échantillons en parallèle à l’aide d’une méthode de haut-débit (Figure 1 a). Des fragments de chromatine devraient se situer entre ~ 200-1000 bits/s pour l’immunoprécipitation optimale. Nous avons noté que le temps nécessaire pour atteindre la même longueur de cisaillement est ...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues at JoVE.com

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur

Nous décrivons ici un protocole de puce-séquençage haut débit optimisé et pipeline analyses calcul pour la détermination de modèles État pangénomique chromatine de lignées de cellules et tissus tumoraux congelés.

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Immunoprécipitation de la chromatine native à l’aide de Neurospheres de tumeur de cerveau murin

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Analyse à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN dans le cancer gastro-intestinal

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Explantations tumorales dérivées de patients en tant que plate-forme préclinique « vivante » pour prédire la résistance aux médicaments chez les patients

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...