Name: an integrated platform for genome-wide mapping of chromatin states using high-throughput chip-sequencing in tumor tissues
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues at JoVE.com

Мы благодарим Маркуса Койл, Кертис Гамбс, ядро SMF в MDACC для поддержки виртуализации. Работа, описанная в этой статье была поддержана грантов от гранта NIH (CA016672) для SMF ядро и NCI награды (1K99CA160578 и R00CA160578) к. р.

Все клинические образцы были получены следующие руководящие принципы институциональных Наблюдательный Совет.
1. буфер подготовка
<ol><li>Сделайте 200 мл TE буфера (10 мм трис-HCl, 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8,0).</li>
	<li>Сделайте 200 мл STE буфера (10 мм трис-HCl, 10 мм Э...

<ol>
	<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulated+Neighborhoods:+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control.">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMARCB1-mediated+SWI/SNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation.">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li><li>J&#228;ger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci.">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178 (2015).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element.">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking.">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li><li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+malfunction+in+cancer.">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification.">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+epigenomes.">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li><li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes.">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors.">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033 (2014).</li><li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity.">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086 (2014).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium.">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li><li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes.">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li><li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromHMM:+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization.">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li><li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS.">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q2ChIP,+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay,+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells.">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development.">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li><li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition.">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1,000+mouse+early+embryonic+cells.">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li><li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method,+Matrix+ChIP:+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events.">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+chromatin+immunoprecipitation+assay.">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).</li><li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data.">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Tang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pyflow-ChIPseq:+a+snakemake+based+ChIP-seq+pipeline.">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li><li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine.">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis.">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li><li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data.">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).</li><li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression.">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans.">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression.">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li><li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing.">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li><li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles.">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li></ol>

Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий высок объём чип seq модуль для картирования генома общесистемной государств хроматина в человека опухоли тканей и клеточных линий. В любом протоколе чип seq одним из наиболее важных шагов является специфичность антитела. Здесь этот метод ил...

Большинство млекопитающих геномов (98-99%) состоит из некодирующих последовательностей, и эти регионы nocoding содержат нормативных элементов, известных участвовать в контроле экспрессии генов и хроматина организации1,2. В нормальной клетке конкретные Ассамблея геномной ДНК в уплотненных хроматина структура имеет решающее значение для пространственной организации, регулирования и точные сроки различных процессов, связанных с ДНК3,4,5. В раковых клеток, однако, chromatin изменения по аномальным эпигенетические механизмы может привести к неправильной Организации структуры хроматина, включая доступ к регуляторных элементов, хромосомные циклической системы и ген выражение модели6, 7,8,9,10.
Несмотря на недавние успехи мы ограничили понимание эпигеномные изменения, которые связаны с опухолевой прогрессии или терапевтического ответа. Epigenome состоит из массива изменений, в том числе меток гистона и метилирование ДНК, которые вместе образуют динамического состояния (упоминаемый как состояние хроматина), которая посягает на выражение генных сетей и других процессов, решающее значение для поддержания Сотовый личность. Недавно изменения в усилители были показаны в множественные злокачественные опухоли, изучая профили H3K27Ac11. Хотя такие исследования дают представление о корреляции изолированных эпигенетических меток, более чем 100 эпигеномные изменения были определены12,13 без четкого понимания их биологических функций и взаимозависимость. Кроме того есть еще большее количество возможных комбинаторной моделей этих гистона и модификации ДНК, и это эти комбинаторной закономерности - не отдельные модификации - диктовать эпигеномные государств14. Таким образом существует огромный необходимость выявления изменений в этих государствах хроматина в прогрессии рака или ответы на терапии. Всесторонние знания о epigenome изменений в раках отставание в части из-за технического (например , поколения крупномасштабных данных из небольшого количества клинического материала/сингл клеток) и аналитический (например алгоритмы для определения комбинаторные государства) проблемы. Таким образом ощущается насущная необходимость для надежные методы высокой пропускной способностью для профилирования большое количество марок изменения гистона из клинического материала и вычислительной подходов в реализации предсказать комбинаторной шаблоны, которые будут способствовать определение эпигеномные государств, связанных с различными этапами tumorigenesis и терапевтической резистентности. Кроме того, данные, поступившие от недавних epigenome профилирования исследования15,16,,1718,19,20,21, 22,23 в нормальных тканей и клеточных линий может быть интегрирована с профилями хроматина опухоли для дальнейшего понимание epigenome вклад биология опухоли.
Хроматин профилирования стала мощным инструментом для выявления глобальных привязки моделей различных chromatin изменения15,-24. В последние годы чип seq стал «золотым стандартом» для изучения ДНК белковых взаимодействий на глобальном масштабе25,,2627. Для любого эксперимента чип seq критические шаги необходимые для его успеха, включая обработку ткани и диссоциации, determing условий оптимального sonication, determing оптимального антитела концентрации для осадков, Библиотека подготовки, После последовательность обработки данных и анализа, ниже по течению. Каждый из этих шагов содержат ключевые качества контрольно-пропускных пунктах и когда вместе взятые, имеют решающее значение для надлежащего выявления потенциальных целей для функциональной проверки. Через инновации в эти шаги несколько предварительного исследования были разработаны методологии для выполнения чип или чип-Seq от небольшого количества ткани28,29,,3031,32 . Кроме того некоторые исследования показали, что протоколы для экспериментов чип высокой пропускной способности, следуют ПЦР на основе количественный33,34. Наконец некоторые публично доступна анализ платформы для чип-Seq данных теперь доступны как Easeq35 и36галактики. Однако хватало интегрированную платформу для выполнения чип-Seq в духе высокой пропускной способности в сочетании с вычислительной трубопровода для выполнения одной марки, а также анализы состояние хроматина.
Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий процесс чип seq для картирования генома общесистемной государств хроматина в опухоль тканей и клеточных линий, с легко следовать руководящим принципам, охватывающий все шаги, необходимые для успешного эксперимента. Приняв метод высок объём ранее описанных Blecher Гонен et al. 37, этот протокол может быть выполнена на десятки образцов параллельно и успешно применяется на линии клеток рака и человеческих опухолей, таких как меланома, толстой кишки, простаты и глиобластомы мультиформной. Мы демонстрируем методологии для шести основных гистона модификаций, которые представляют собой основные компоненты эпигеномный нормативные ландшафт в человека меланомы клеточных линий и образцов опухоли. Эти изменения включают в себя H3K27ac (усилители), H3K4me1 (активных и готова усилители), H3K4me3 (промоутеры), H3K79me2 (транскрибируется регионов), H3K27me3 (polycomb репрессии) и H3K9me3 (гетерохроматиновые репрессии). Эти метки может использоваться отдельно или в сочетании для выявления государств функционально различных хроматина, представляющих репрессивных и активных доменов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K4me1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K27ac antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K4me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K79me2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K27me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K9me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris HCl, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma - Life Sciences</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TWEEN-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - IgG-free</td>
			<td>Sigma - Life Sciences</td>
			<td>A2058-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibo</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C tube</td>
			<td>GentleMACS</td>
			<td>120-008-466</td>
			<td>disassociation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde</td>
			<td>Peierce</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniProtease inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>protease inhibitor tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10009D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor NGS tubes 0.65 mL</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C30010011</td>
			<td>sonication tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag - 96 Side Skirted</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120.27</td>
			<td>96-well magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100005393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>paramagnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7645L</td>
			<td>DNA Library Prep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7335L</td>
			<td>Multiplex Oligos&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7500L</td>
			<td>Multiplex Oligos&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 4200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>high sensitivity DNA electropherogram instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico sonication device&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td>water bath disruputor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer</td>
			<td>Nutator</td>
			<td>421105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet</td>
			<td>Denville</td>
			<td>1003123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Skirted Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>47744-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-12R Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99464</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620461</td>
			<td>tabletop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strips (8x Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8x strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Tips, 10 Pk</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA MS3 vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated platform for genome-wide mapping of chromatin states using high-throughput chip-sequencing in tumor tissues

Изменения гистона являются одним из основных компонентов epigenome и играют важную роль регулирования в определении транскрипционный анализ статуса ассоциированных локусов. Кроме того наличие конкретных изменений был использован для определения позиции и личность-кодирования функциональных элементов, таких как усилители. В последние годы иммунопреципитации chromatin, следуют следующего поколения последовательности (чип seq) стал мощным инструментом определения генома общесистемной профилей отдельных гистона модификаций. Однако это становится все более очевидным, комбинаторные шаблоны изменений chromatin, называют Chromatin государствами, определить личность и характер связанных геномной Локус. Таким образом рабочие процессы, состоящие из надежной методологии (HT) высок объём для профилирования количество меток гистона модификации, а также Вычислительный анализ трубопроводов способна обработки мириады чип-Seq профилирование наборов данных, необходимых для всеобъемлющее определение государств epigenomic в большое количество проб. HT-чип-Seq рабочего процесса, представленные здесь состоит из двух модулей: 1) экспериментальный протокол для профилирования нескольких модификаций гистона от небольших количеств образцов опухоли и клеточных линий в 96-луночных формате; и 2) вычислительные данные анализа трубопровода, который объединяет существующие инструменты для вычисления отдельные Марк размещение и комбинаторные хроматина состояние модели. Вместе эти два модуля облегчить легкая Обработка сотни образцов чип-Seq быстрым и эффективным образом. Рабочий процесс, представленные здесь используется для получения структур хроматина государства от 6 гистона Марк профилей в меланома опухоли и клеточных линий. В целом мы представляем всеобъемлющий чип seq рабочий процесс, который может быть применен к десятков образцов человека опухоли и рак клеточных линий для определения epigenomic аберраций в различных злокачественных опухолей.

Этот протокол позволяет иммунопреципитации из замороженных опухолевых тканей и клеточных линий, которые могут быть выполнены на десятки образцов параллельно с использованием метода высок объём (рис. 1A). Хроматина фрагменты должны варьироват...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues at JoVE.com

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Интегрированная платформа для картирования генома общесистемной Chromatin государств с использованием высокопроизводительный чип последовательности в тканях опухоли

Здесь мы описываем, оптимизированный протокол чип последовательности высокой пропускной способностью и трубопровод Вычислительный анализ для определения генома общесистемной хроматина состояния моделей из замороженных опухолевых тканей и клеточных линий.

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

The overall goal of this protocol is to unbiasedly identify combinatorial chromatin state patterns in tumor tissues and cancer cell lines. This method could help answer key questions in the cancer epigenetics field such as how a barren histone modification states could contribute to tumor genesis. The main advantage of this technique is that multiple histone modifications, as well as multiple samples could be processed both simultaneously, as well as efficiently.First, dissociate 50 milligrams of melanoma tissue manually and two milliliters of Hank's Balanced Salt Solution or HBSS, using a sterile razor blade. Mince the tissue into three or four millimeter pieces for approximately five minutes in a sterile tissue culture dish. Transfer the tissue solution to a dissociator tube and add another eighth milliliters of HBSS.Further dissociate the tissue, using a dissociator, until homogenized. Next, crosslink the tissue, adding 200 microliters of 16%formaldehyde per three milliliters of HBSS. Using a mixer, shake the mixture at 10 rpms for exactly 10 minutes at 37 degrees Celsius.After removing the sample from the incubator, add 200 microliters of tumoral glycine per three milliliters of sample and shake the mixture at 10 rpms for five minutes at 37 degrees Celsius. Spin the sample at 934 times g for five minutes at four degrees Celsius using a bench top centrifuge. When finished, remove the supernatant and add five milliliters of ice cold PBS.Then, centrifuge the sample again at 934 times g then remove the supernatant. Add 300 microliters of ChIP harvest buffer with protease inhibitors per 50 milligrams of tissue and lyse the samples for 30 minutes on ice. While the cells are lysing, turn on the water bath disruptor and associated cooling system and allow the temperature to reach four degrees Celsius.Place the sonicator tube in the water bath disruptor and sonicate the melanoma tissue for 60 cycles at 30 seconds on and 30 seconds off to obtain chromatin fragments of 200 to 600 base pairs. For eight milligrams of melanoma tissue, incubate three micrograms of each histone antibody with 20 microliters of protein g magnetic beads and 100 microliters of binding blocking buffer for two hours at four degrees Celsius with rotation, using a tube revolver. After sonication, dilute the sample five times using ChIP dilution buffer to bring the SDS concentration down to 0.1%After incubation of the antibody and protein g magnetic beads is complete, remove the ChIP dilution buffer and re suspend the beads in 240 microliters of the fresh buffer.Then, place 20 microliters aliquots of the beads into 12 separate tubes, each of which will be used for a separate tissue sample. Aliquot the sonicated material evenly to the protein g beads with specific antibody and rotate the tubes using a tube revolver overnight at four degrees Celsius. On the morning after reverse cross linking, transfer the antibody protein solution to a 96 well plate and place it on a magnetic stand.After allowing the beads to adhere for at least 30 seconds, remove the supernatant. Wash the beads five times with 150 microliters of ice cold RIPA wash buffer using a multi channel pipette. Move the magnet continuously for 30 seconds per wash, then remove the supernatant.After the washing steps, add an elution buffer master mix, containing 44 microliters of direct elution buffer, one microliter of Rnase and five microliters of protenase k per chip and input the sample for reverse cross linking. Incubate the samples using a PCR thermal cycler for four hours at 37 degrees Celsius, four hours at 50 degrees Celsius and eight to 16 hours at 65 degrees Celsius. On the next morning, place the samples back on the magnet and transfer the supernatant to a new 96 well PCR plate which contains the amino precipitated DNA.Add 2.3 x paramagnetic beads to the solution and carefully pipette up and down 25 times using a multi channel pipette. Following this, incubate at room temperature for four minutes. Then place the samples back on the magnet and incubate at room temperature for another four minutes.After discarding the supernatant, add 150 microliters of 70%ethanol to the samples and incubate at room temperature for 30 seconds without disturbing the beads. After allowing the beads to dry, remove the samples from the magnet and add 30 microliters of 10 millimolar traceal. Mix by pipetting 25 times.After incubating the samples at room temperature, place them back on the magnet and incubate at room temperature for another four minutes. Transfer 20 microliters of each sample to a new 96 well plate for library preparation. After PCR amplification, remove the samples and bring the total volume to 100 microliters using nucleus free water.Perform double sided paramagnetic size selection by first adding 55 microliters of beads to each sample and mixing 25 times with a pipette. Then incubate at room temperature for four minutes. Place the samples back on the magnet and incubate at room temperature for another four minutes to attain large fragments on the beads that are unsuitable for sequencing.After incubation, transfer the supernatant to a new 96 well PCR plate. Add another 25 microliters of paramagnetic beads and mix by pipetting 25 times and incubate at room temperature off the magnet for four minutes. After incubating at room temperature, place the samples back on the magnet and incubate at room temperature for four minutes.Then discard the supernatant. While leaving the samples on the magnet, add 150 microliters of 70%ethanol and incubate at room temperature for 30 seconds without disturbing the beads. Remove the ethanol and repeat the wash.After allowing the beads to dry, remove the samples from the magnet and add 25 microliters of 10 millimolar traceal pH 8.0. Mix by pipetting 25 times and incubate at room temperature, off the magnet for four minutes. After incubating at room temperature, place the samples back on the magnet and incubate at room temperature for four minutes.Now, quantify the libraries using a high sensitivity DNA electropherogram instrument before multiplexing to ensure the sizes are suitable for sequencing. This protocol allows immunoprecipitation of frozen tumor tissues and cell lines that can be performed on dozens of samples and parallel using a high throughput method. Chromatin fragments should range between 200 and 1000 base pairs for optimal immunoprecipitation.Purified ChIP DNA should be quantified before proceeding to library preparation. Completed libraries suitable for multiplexing and next generation sequencing should range between 200 and 600 base pairs and be devoid of any primer dimers. Upon post sequencing, there are many quality control metrics that should be met before proceeding to further steps of the pipeline, such as macs peak calling and chromHmm analysis.ChIP samples should be enriched over input DNA and each histone modification should display a distinct profile representing a specific component of the epigenetic landscape. The chrome HMM algorithm uses a Multivariate Hidden Markov Model to identify the most prominent reoccurring combinatorial and spacial chromatin patterns based on the histone modifications studied. Using these six modifications, chrome HMM identifies functionally distinct chromatin states representing both repressive and active domains, such as polycomb repression, heterochromatic repression, active transcription, and active enhancers.Once mastered, this technique can be done in three to four days, if it's performed properly. While attempting this procedure, it's important to determine optimal sonication conditions and specification for antibodies before continuing to library preparation and data analysis. For learning this procedure, other methods, such as RRS sequencing and chromosome confirmation capture can be performed to determine coalition of chromatin state parts with gene expression and higher chromatin structure.After the experiment, the technique has paved way for researchers in cancer epigenetics field to explore chromatin state patterns in patient tumor samples. After watching this video, you should have a good understanding of how to process and disassociate tumor tissues, perform chromatin immunoprecipitation, prepare libraries for nextgen sequecing, process post sequencing data and gain insights into initial steps of downstream analysis. Don't forget that when working with formaldehyde, it can be extremely hazardous and precautions, such as an appropriate fume hood, should always be taken when performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Создание колонизации Assay легких для циркулирующих визуализации опухолевых клеток в тканях легких

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Геном всей RNAi скрининг для выявления факторов хоста, которые модулируют вирус онколитического терапии

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Иммунопреципитация родной Chromatin, с использованием Neurospheres опухоли мозга мышиных

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Создание и характеристика малого кишечника нейроэндокринных опухолевых сфероидов

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Геном-Широкий анализ метилирования ДНК при раке желудочно-кишечного тракта

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Экспланты опухолей, полученные от пациентов, как «живая» доклиническая платформа для прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...