Name: clonal analysis of embryonic hematopoietic stem cell precursors using single cell index sorting combined with endothelial cell niche co-culture
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture at JoVE.com

ברצוננו להודות אנדרו ברגר, סטייסי Dozono, בריאן Raden פרד האצ'ינסון Flow Cytometry הליבה לקבלת סיוע עם FACS. עבודה זו נתמכה על ידי המענק נבחרת מוסדות של בריאות NHLBI UO1 #HL100395, נלווים-שיתופי גרנט #HL099997, NIDDK הענק #RC2DK114777. ברנדון Hadland נתמך על ידי אלכס של לימונדה לעמוד קרן ותקווה יונדאי על בסיס גלגלים.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן.
1. הכנת AGM-EC Monolayers לתרבות משותפת
<ol><li>24 שעןת לפני ניתוח AGM ומיון, להפוך AGM-EC תרבות המדיה מסנן לחטא.</li>
	<li>להוסיף ג'לטין 0.1% במים (100 µL טוב) כל טוב של צלחת 96-ובכן דגירה בטמפר?...

<ol>
	<li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage.">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li><li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells/long-term+repopulating+units+(HSC/RUs):+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+(AGM)+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver.">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).</li><li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin+CD45++pre-definitive+HSCs.">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li><li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region.">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li><li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent,+IL-3-independent+CD43(-)+embryonic+precursor.">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li><li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo.">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li><li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection.">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li><li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region.">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li><li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations.">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li><li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus.">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes.">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li><li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis.">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li><li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells.">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells.">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li><li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells.">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells.">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li><li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations.">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li><li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM.">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta.">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li><li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis:+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression.">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li><li>Holmes, R., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).</li><li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo.">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf&#946;+for+their+development.">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbf&#946; for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li><li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence.">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li><li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development.">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li><li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis:+emergence+of+erythroid,+megakaryocyte,+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo.">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li></ol>

המחקר של מועדון הכדורגל מונפלייה בראשית במהלך התפתחות עובריים מחייבת אמצעי לגילוי HSC פוטנציאל מבשרי hemogenic עדיין חסר את היכולת לספק הכינון hematopoietic multilineage לטווח ארוך ב המושתלים נמענים למבוגרים. פרוטוקול זה, אנו מציגים וזמינותו המשובטים של סימנים מקדימים hemogenic עובריים מאת סטרומה תרבות משותפ...

המשובטים מחקרים גילו הטרוגניות במאפיינים engraftment לטווח ארוך של HSCs למבוגרים, לספק תובנה חדשה HSC יחוברו ושינויים בהתנהגות HSC במהלך ההזדקנות1. עם זאת, מחקרים דומים של HSCs עובריים ו מבשרי שלהם כבר יותר מאתגר. במהלך התפתחות עוברית מוקדמת, HSCs נובעים אוכלוסיה של סימנים מקדימים המכונה hemogenic אנדותל בתהליך ארעי התייחס כאל אנדותל המעבר hematopoietic2. הראשונה מועדון הכדורגל מונפלייה, שהוגדרו על-ידי היכולת שלהם לספק engraftment multilineage חזקות, לטווח ארוך בעקבות השתלת לתוך נמענים למבוגרים ממוזגים, לא מזוהים עד לאחר יום עובריים 10.5 (E10.5) בהעובר מאתר, תדירות נמוכה מאוד3 . במהלך התפתחותם, המבשרות על מועדון הכדורגל מונפלייה (pre-HSC) הנובעות hemogenic אנדותל חייב לעבור התבגרות לפני רכישת מאפייני HSC למבוגרים המאפשרים engraftment יעיל השתלת מבחני4,5 , 6. פגיעה ביעילות המחקר ממוצא HSC נדירים, שפע של אבות hematopoietic עם erythroid, פוטנציאל מיאלואידית, ו הלימפה כבר זוהו לפני ייסודה של מועדון הכדורגל מונפלייה טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה7,8. לפיכך, שיסייעו לך לייחד טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה אבות hematopoietic אחרים דורש שיטות clonally בידוד תאי, לספק להם האותות מספיק עבור ההבשלה שלהם כדי HSC, לזהות את המאפיינים engraftment שלהם מבחני השתלת.
מספר גישות תוארו המאפשרות איתור קדם-מועדון הכדורגל מונפלייה על ידי התבגרות או ex-vivo או vivo כדי HSC. שיטות שמחוץ היו תלויים תרבות של רקמות עובריים, כגון האזור AGM, איפה מועדון הכדורגל מונפלייה הראשון מזוהים פיתוח9. על שיטות אלה, פרוטוקולים אשר משלבות את הדיסוציאציה, מיון של צבירת מחדש של רקמות AGM התירו אפיון אוכלוסיות ממוינים המכיל HSC מבשרי במהלך הפיתוח מ E9.5 ל E11.5 ב פארא-ותיני splanchnopleura (P-Sp) / AGM אזורים4,5,10; עם זאת, גישות אלה אינם לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של סימנים מקדימים ברמת תא בודד נדרש לניתוח המשובטים. באופן דומה, אין ויוו ההבשלה על ידי השתלת לתוך עכברים היילוד, איפה microenvironment המשוער יהיה מתאים יותר התמיכה של שלבים מוקדמים של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי, איפשר גם מחקרים על אוכלוסיות ממוינים מן החלמון AGM / P-Sp (P-Sp הוא האזור קודמן כדי ומזכיר האסיפה) עם מאפיינים של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה, אבל השיטות האלה גם להיכשל כדי לספק פלטפורמה חזקה ליחיד תא ניתוח11,12.
לימודי Rafii. et al. הפגינו שאת משתית תא אנדותל לפעיל על-Akt (EC) מספקים מצע נישה עבור התמיכה של מבוגרים HSC התחדשות עצמית במבחנה13,14,15. אנחנו נקבע לאחרונה כי מופעל Akt EC נגזר מן האזור AGM (AGM-EC) מספק משרה מתאימה במבחנה ההבשלה של מבשרי hemogenic, מבודד מוקדם ככל E9 בפיתוח, כדי engrafting למבוגרים מועדון הכדורגל מונפלייה, כמו גם עוקבות התחדשות עצמית של מועדון הכדורגל מונפלייה שנוצר16. נתון כי מערכת זו מעסיקה תרבות משותפת 2-ממדי פשוטה, זה בקלות להתאמה לניתוח המשובטים של הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic מבודדים בנפרד.
לאחרונה דיווחנו גישה assay הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים על-ידי שילוב מדד מיון של סימנים מקדימים hemogenic בודדים מעוברים מאתר עם תרבות משותפת AGM-EC, אנליזה פונקציונלית הבאים בהשתלת מבחני17. אינדקס מיון הוא תא מצב של לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) את הרשומות (אינדקסים) כל הפרמטרים פנוטיפי (קרי, פיזור קדמי (FSC-A), לצד פיזור (האס-A), קרינה פלואורסצנטית פרמטרים) של כל תא בנפרד ממוינים כזה אלו תכונות ישויך retrospectively כדי שלאחר מכן אנליזה פונקציונלית בעקבות מיון. תוכנה FACS רשומות הן מידע פנוטיפי עבור כל תא, הבאר/המיקום של צלחת 96-ובכן בו היא מוצבת. טכניקה זו בעבר שימש באלגנטיות כדי לזהות הטרוגניות במועדון הכדורגל מונפלייה למבוגרים, לקבוע פרמטרים פנוטיפי נוספת להעשיר עבור המשנה engrafting לטווח ארוך של מועדון הכדורגל מונפלייה, לתאם את הפרמטרים פנוטיפי של מועדון הכדורגל מונפלייה עם תעתיק מאפיינים-הסינגל תא רמה18,19. כאן, אנו מספקים נתונים היסטוריים מתודולוגיה של גישה זו, אשר מאפשרת זיהוי של פרמטרים ייחודיים פנוטיפי ו שושלת היוחסין תרומות של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה בשלבים המוקדמים של התפתחות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AGM-EC culture media </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for culture of endothelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>Use to dissociate AGM-EC monolayers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin 0.1% in water</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Use for dissection and FACS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml filter bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9741202</td>
			<td>Use to sterile filter Endothelial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM-EC culture media (500 mls)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>400 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>100 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>5 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>50 mg dissolved in 10 mls media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7100</td>
			<td>5 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Mitogen (ECGS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64516 (BT-203)</td>
			<td>Add 10 mls media to dissolve and add</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for AGM index sort</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (0.25%)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7902</td>
			<td>Use for dissociation of embryonic tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309657</td>
			<td>Use to sterile filter antibody solutions for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M syringe-driven filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Use to sterile filter antibody solutions for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>Use to remove cell clumps prior to FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>268298</td>
			<td>Use to exclude dead cells from sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/CD32 (FcR block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Use to block non-specific staining to Fc receptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for AGM index sort</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1441-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4301-81</td>
			<td>Isotype control for CD144 PE-Cyanine7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-2012-80</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-4031-80</td>
			<td>Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558040</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553925</td>
			<td>Isotype control for CD41 PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-4031-81</td>
			<td>Isotype control for CD45 FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM-serum free media (10mls)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Vivo 20</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-448Q</td>
			<td>10 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine stem cell factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td>10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td>2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine interleukin-3 (IL3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td>2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Staining co-cultured cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td>Use for FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-0451-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>35-4031-80</td>
			<td>Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-2012-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-81</td>
			<td>Isotype control for CD201 PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5981-83</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4321-81</td>
			<td>Isotype control for Ly-6A/E APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-4801-81</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-4321-41</td>
			<td>Isotype control for F4/80 FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556923</td>
			<td>Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for tail vein injection for transplant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2&#34; needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309306</td>
			<td>Use for tail vein injection for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108426</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400629</td>
			<td>Isotype control for Ly-6G/C PerCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td>Isotype control for F4/80 PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555274</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550992</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td>Isotype control for CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0453-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4321-81</td>
			<td>Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0454-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-4321-80</td>
			<td>Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II with DIVA software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II with plate reader</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17040</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-559-417</td>
			<td>For dispensing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS analysis software</td>
			<td>FlowJo/BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal analysis of embryonic hematopoietic stem cell precursors using single cell index sorting combined with endothelial cell niche co-culture

היכולת ללמוד תאי גזע hematopoietic (HSC) בראשית במהלך התפתחות עובריים יש היה מוגבל על-ידי בנגישות של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי ב העובר מוקדם והיעדר מבחני שמזהים את הפוטנציאל multilineage engraftment לטווח ארוך של פונקציונלית בודדים בשם HSC סימנים מקדימים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המאפשרת את בידוד ואפיון של מבשרי HSC מאומתים באופן פונקציונלי ברמת תא בודד. ראשית, אנו מנצלים אינדקס מיון לקטלוג הפרמטר פנוטיפי מדויק של כל תא בנפרד ממוינים, באמצעות שילוב של סמנים פנוטיפי להעשיר עבור מועדון הכדורגל מונפלייה סימנים מקדימים עם סמנים נוספים עבור ניתוח ניסיוני. שנית, כל תא ממוין אינדקס הוא תרבותי משותף עם נישה וסקולרית משתית מאזור (AGM) אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros, אשר תומכת ההבשלה של הלא-engrafting מועדון הכדורגל מונפלייה המבשרות על HSC פונקציונלי עם פוטנציאל multilineage, לטווח ארוך engraftment מבחני השתלת. מתודולוגיה זו מאפשרת המתאם המאפיינים פנוטיפי של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים עם הפוטנציאל שלהם engraftment תפקודית או מאפיינים אחרים כגון פרופיל תעתיק, מתן אמצעים לניתוח מפורט של מועדון הכדורגל מונפלייה קודמן פיתוח ברמה תא בודד.

איור 1A מראה סכימטי של הנבחנים. פעם אחת P-Sp/AGM רקמות הם גזור, איחדו ולאחר הפומבית של collagenase, הם מוכתמים נוגדנים VE-קדהרין, EPCR למיון אינדקס. Pre-מועדון הכדורגל מונפלייה מועשרים בתאים ממוינים VE-קדהרין+EPCRגבוהה (איור 1B). נוגדנים fluorochrome מצו...

Watch this Scientific Journal Video about Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture at JoVE.com

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

The overall goal of this method is to identify the phenotypic properties and engraftment potential of clonal Hematopoietic Stem Cell or HSC precursors during murine embryonic development. This method can help answer key questions in the field of developmental hematopoiesis about the unique lineage contributions of clonal HSC precursors during embryonic development. The main advantage of this technique is that hemogenic precursors are analyzed at the single cell level.This allows identification of the unique phenotypic properties that distinguish rare HSC precursors. Begin by adding Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, tissues dissected from embryos between 9.5 and 11.5 days post coitum to a 15 milliliter conical tube containing 10 milliliters of PBS supplemented with 10%FBS on ice. When the tissues have settled to the bottom of the tube, aspirate the supernatant and immediately add one milliliter of 0.25%collagenase to the samples.After 25 minutes in a 37 degree Celsius water bath, stop the reaction with one milliliter of PBS plus FBS and use a one milliliter pipette tip to triturate the tissues 20 to 30 times until a single cell suspension is obtained. Then dilute the cells with eight more milliliters of PBS plus FBS and collect the cells by centrifugation. Resuspend the pellet in 500 microliters of blocking buffer for five minutes on ice.Then add 500 microliters of the antibody cocktail of interest. After a 15 to 20-minute incubation on ice, wash the cells in eight milliliters of PBS plus FBS and resuspend the pellet in one milliliter of fresh PBS plus FBS. Filter the cells through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter tube, washing the strainer with an additional three milliliters of PBS plus FBS to collect all of the cells and centrifuge the cells again.Then resuspend the pellet in 500 microliters of PBS plus FBS and place the cells on ice. To set the gates for sorting in single cell and index sorting mode, load a small aliquot of cells onto the flow cytometer and set the acquisition to the lowest flow rate. Open a forward scatter area versus side scatter area plot and set a gate to include cells of varying size.Open a forward scatter area versus forward scatter width plot and a side scatter area versus side scatter width plot and set a gate in each plot to exclude the doublets. Set a forward scatter area versus DAPI plot to gate the live cells. Then create an anti-vascular endothelial Cadherin versus anti-endothelial protein C receptor plot and gate the vascular endothelial Cadherin positive and high endothelial protein C receptor expressing cells.To index sort the aorta-gonad-mesonephros cells, place a 96-well plate precultured with AGM endothelial cells in AGM serum-free medium plus cytokines into the plate block of the flow cytometer and load the experimental sample. Begin the sample acquisition and confirm that the index sorting single cell mode is selected to sort a single cell into each well of the 96-well plate. When one cell has been sorted into each well of the plate, place the plate into a tissue culture incubator set to 37 degrees Celsius and 5%CO2 for up to seven days.At the end of the co-culture period, hematopoietic colonies of various sizes and morphologies can be visualized using an inverted microscope at a 100X magnification. To analyze the clones by flow cytometry, use a multichannel pipette to dissociate the hematopoietic cells from the endothelial layers without detaching the endothelial cells. Then transfer 100 microliters of cells into individual wells of a new 96-well v-bottom plate and return the original 96-well plate containing the remaining 100 microliters of cells to the tissue culture incubator.Pellet the cells in the v-bottom plate by centrifugation and remove the supernatant by inverting and flicking the plate in a single rapid motion. Resuspend the pellets in each well with 50 microliters of blocking buffer at four degrees Celsius. After five minutes, add the antibody cocktail of interest to each well for a 20-minute incubation at four degrees Celsius.At the end of the incubation, wash each well with 200 microliters of PBS plus FBS, flicking the plate at the end of the centrifugation to discard the supernatant. Resuspend the pellets in 50 microliters of PBS plus FBS and analyze the cells according to standard flow analysis protocols to screen for colonies that contain hematopoietic stem cell potential. Selecting the wells that contain cells with hematopoietic stem cell phenotype by flow analysis, use a multichannel pipette to resuspend the remaining 100 microliters of cells from the original co-culture and add five times 10 to the fourth rescue bone marrow cells in 100 microliters of PBS plus 2%FBS to each well.After adoptive transfer of each clone into individual lethally irradiated congenic recipient animals, collect peripheral blood samples from the engrafted animals at regular intervals post transplant. To identify the clones with long-term engraftment, analyze the samples by flow cytometry according to standard flow analysis protocols. The phenotypic properties of each clone can then be correlated with its engraftment properties.Pre-hematopoietic stem cells can be enriched by vascular endothelial Cadherin positivity and a high level of endothelial protein C receptor expression. Staining with other fluorochrome conjugated antibodies allows the retrospective analysis of additional phenotypic parameters that can be recorded for each cell during index sorting. Following index sorting into aorta-gonad-mesonephros endothelial cell co-cultures, the individual clones integrate into the aorta-gonad-mesonephros endothelial cell layer before the clones begin to round up and form hematopoietic clusters.After five to seven days of co-culture, colonies of various sizes and morphologies can be detected. Here, four different colonies obtained following co-culture are shown with three colonies demonstrating different proportions of phenotypic hematopoietic stem cells along with other more differentiated cell types and the fourth colony lacking cells with hematopoietic stem cell marker expression. Adoptive transfer of the clone cell progeny allows assessment of the long-term multi-lineage engraftment capability of each clone following donor contribution to the myeloid B and T cell compartments of the peripheral blood of the recipient over time.Although most colonies containing cells with a hematopoietic stem cell phenotype achieved long-term engraftment, transplantation is necessary to confirm a functional multi-lineage engraftment as some clones lose engraftment over time. The functional hematopoietic stem cell potential of each clone can then be correlated back to that clone's original index sorting parameters to identify its precise phenotypic characteristics. Following this procedure, other methods like secondary culture of hematopoietic progeny on stroma supporting B and T cell development in vitro can be performed to answer additional questions about the lymphocyte potentials of individual hemogenic precursors.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...