Name: in vivo gene transfer to the rabbit common carotid artery endothelium
Uploaded: 2018-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium at JoVE.com

Wir bedanken uns bei AdVec, Inc. für die Erlaubnis zur Nutzung ADHD Reagenzien, Julia Feyk für die Amtshilfe und die Abteilung für vergleichende Medizin Veterinärdienste für chirurgische Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch HL114541 und die John L. Locke, Jr. Charitable Trust unterstützt.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der University of Washington Büro Tierschutz und institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) genehmigt, und abgeschlossen in Übereinstimmung und Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien.
Hinweis: Gentransfer in gemeinsamen Halsschlagadern Hase Kaninchen von einem Chirurgen mit Hilfe eines Anästhesisten oder Assistent erfolgt.
(1) Gentransfer auf gemeinsame Halsschlagadern Kaninchen: vor der Operation
<ol><li>Di...

Bestimmte Aspekte der Operationstechnik verdienen besondere Aufmerksamkeit. Volle Belichtung und Mobilisierung der gemeinsame Halsschlagader über sorgfältige Dissektion wird gen-Transfer und arteriotomie Reparatur zu erleichtern. Allerdings sollten während der Dissektion, direkte Manipulation der Halsschlagader minimiert werden, um Vasospasmus zu verhindern. Darüber hinaus eine Blutung angrenzend an die Arterie angehalten werden sollte, durch leichte Druckmassage mit Gaze und extravasierten Blut bereinigt werden soll...

Das Ziel dieser Methode ist, ein Transgen in das Endothel der gemeinsamen Halsschlagadern Kaninchen einzuführen. Einführung des Transgens ermöglicht die Beurteilung der biologischen Rolle der Transgen-Produkt sowohl in normalen Arterien Kaninchen Modelle der menschlichen arteriellen Verschlusskrankheit. Überexpression des Transgens in Krankheitsmodellen kann zeigen, ob das Transgen (und seine Proteinprodukt), Versprechen als Therapeutika1,2,3,4 zeigen. Einbeziehung der GUS wirkenden regulatorische Elemente in der Transgen-Expressionskassette erlaubt eine Beurteilung der Aktivität dieser Elemente im arteriellen Endothel in Vivo5,6. Kenntnisse über die Aktivität der spezifischen GUS wirkenden regulatorische Elemente kann mehr aktive Expressionskassetten gestalten und Mechanismen der Genregulation in große Arterie Endothel in Vivo7Sonde verwendet werden.
Kaninchen sind ein wertvolles Modell für die verschiedenen Aspekte der menschlichen vaskuläre Physiologie und Krankheit. Kaninchen haben viele vaskuläre Merkmale mit den Menschen. Beispielsweise ähneln hämatologischen Ausgangswerte, blutstillende Regulierung und vaskuläre Längsspannung zwischen Kaninchen und Menschen8. Kaninchen-Modelle von Gefäßerkrankungen Replizieren der wichtigsten Features von vielen menschlichen Krankheiten einschließlich: Aneurysmen (ähnliche geometrische und Fließeigenschaften)9, Vasospasmus (ähnliche Reaktion auf die endovaskuläre Behandlung)10,11, und Atherosklerose (Intima Plaketten mit ähnlichen Eigenschaften, einschließlich einen Kern reich an Lipid, Makrophagen und glatten Muskelzellen in einer fibrösen Kappe)12,13. Entsprechend, Kaninchen-Modelle wurden für viele Gefäßerkrankungen wie Thrombose, vasospasmen, Aneurysma, Diabetes, Gefäßprothese Stenose und Arteriosklerose8,13,14, 15,16.
Für die Forscher unter Tiermodellen für vaskuläre Physiologie und Krankheit zu wählen hat die Kaninchen mehrere Vorteile. Im Vergleich zu Nagern, ermöglichen größere Schiffe von Kaninchen einfachere chirurgische Manipulation, Verwendung von endovaskuläre Prothesen und eine größere Menge des Gewebes für quantitative Messungen. Kaninchen sind phylogenetisch Primaten als Nagetiere17sind viel näher, und die größere genetische Vielfalt der fremd-Kaninchen besser approximiert die genetische Variabilität des Menschen. Genetischer Vielfalt ist besonders wichtig für präklinische Studien, die-durch ihre Natur-Ziel, Therapien zu entwickeln, die genetisch vielfältigen menschlichen Bevölkerung angewendet werden können. Wie mit vielen, wenn nicht alle anderen Modell Arten Kaninchen Gene einfach geklont oder synthetisiert, weil mit hoher Abdeckung der Kaninchen-Genom sequenziert hat (7,48 X) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Im Vergleich zu anderen großen Tiermodellen (wie Hunde, Schweine oder Schafe), Kaninchen sind relativ kostengünstig zu erwerben und Haus und sie sind einfacher zu züchten und zu handhaben. Spezifische Gefäßerkrankungen Modelle bei jedem Kaninchen haben ihre eigenen vor- und Nachteile als Modelle für menschliche Krankheiten, die über den Rahmen dieses Manuskript8,12,18sind. Ein Ermittler sollten überprüfen, diese vor- und Nachteile zu ermitteln, ob das Kaninchen das beste Modell für eine spezifische experimentelle Frage zu beantworten ist.
Einführung der Desoxyribonukleinsäure (DNA) regulatorischen Sequenzen in Endothelzellen in Vivo ermöglicht die Untersuchung der Aktivität dieser Sequenzen in einem komplexen physiologischen Umfeld. In-vitro- Studien in transfizierten Endothelzellen können nützlich für die Erstbewertung von regulatorischen DNA-Sequenzen sein; jedoch sind Ausdruck Niveaus in Gewebekultur Modelle manchmal nicht wiedergegeben, wenn die Studien wiederholt in Vivo5,19,20sind. In-vitro- Systeme können auch für die Erkundung von grundlegenden Wege der Protein-Signalisierung und endotheliale Physiologie sowie Kommunikation zwischen kultivierten vaskuläre Zellen nützlich sein; jedoch sind komplexere Wege oder regulatorische Netzwerke, die durch komplexe Populationen von vaskulären Nachbarzellen oder das Immunsystem beeinflusst werden am besten in einem in Vivo System6,20studiert. Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform für die Regulierung des Transgens Ausdruck in dem Endothel im Rahmen eines intakten Schiffes, mit oder ohne Krankheit zu erforschen. Das in-Vivo -System erlaubt auch Untersuchung der physiologischen und pathologischen zellulären Übersprechen und Identifikation von Beiträgen des Immunsystems zur Regulierung der Gen-Expression-6.
Keimbahn Transgenese (vor allem bei Mäusen) ist ein alternativer Ansatz für die Leitung der Transgene Ausdruck Endothelzellen. Dieser Ansatz bieten lebenslange Transgene Ausdruck mit endothelialen targeting vermittelt durch spezifische Promoter oder regulatorischen Regionen21,22. Aber die Generation von transgenen Mäusen ist zeitaufwändig und teuer, mehrere transgene Linien müssen oft getestet werden, um sicherzustellen, Ausrichtung des Transgens auf die gewünschte Zelle Art und Leistung angemessene Transgene Ausdruck Niveaus, und experimentelle Ergebnisse in murinen Systeme können Belastung abhängig sein. Murine transgene Modelle mit endothelialen gezielt transgene haben viele Vorteile: Es gibt keine Notwendigkeit, auf jedes Versuchstier operieren, um Transgenese zu erreichen, experimentellen Mäuse gezüchtet werden können, mit zahlreichen anderen verfügbaren Transgene Mäuse in um genetische und phänotypische Interaktionen zu testen, und gibt es eine große Auswahl an Antikörpern, die mit murinen Proteinen, Erleichterung der Charakterisierung von Phänotypen zu reagieren. Ausrichtung der Transgene des Endothels über die Keimbahn in der Regel führt jedoch Transgene Ausdruck in das Gefäßsystem,22 macht es schwierig, die Website zu bestimmen, an der das Transgen-Produkt handelt. Dies gilt insbesondere wenn das Transgen Produkt abgesondert wird, weil ein Transgen Produkt sezerniert Endothelzellen in das Gefäßsystem biologischen Aktivität an vielen verschiedenen Standorten innerhalb eines Tieres haben könnte. Obwohl in diesem Manuskript beschriebene Methode Fachwissen und spezialisierte Einrichtungen erfordert, kann es weniger zeitaufwendig und weniger teuer als die Entwicklung einer endothelialen-spezifische transgene mauslinie. Es ermöglicht die Beurteilung der Funktion eines Proteins selektiv in Endothelzellen eines Segments große Arterie, und es erlaubt die Verwendung von der kontralateralen gemeinsame Halsschlagader als gekoppelte Steuerung (Beseitigung systemische Faktoren, die unter experimentellen variieren kann Tiere-zum Beispiel Blutdruck oder Cholesterinspiegel-als unkontrollierte Variablen).
Gentherapie ist ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von Gefäßerkrankungen, insbesondere chronische Erkrankungen, weil eine einzelne Anwendung nachhaltig oder möglicherweise lebenslange Ausdruck einer therapeutischen Gens23bieten kann. Das therapeutische Versprechen der Gentherapie ist in Tiermodellen der somatischen Gentransfer, oft gezielt die Leber24,25, ein relativ leichtes Ziel ist, weil viele Blut übertragbare virale Vektoren Hepatotropic untersucht worden. Jedoch muss um auf Gefäßerkrankungen auswirken, Gentherapie, die gezielt auf die Leber systemische Überexpression von Proteinen erreichen. Dies erfordert in der Regel große Dosen des Vektors, die giftige oder tödliche26sein kann. Darüber hinaus höhere systemische Protein erhöhen das Risiko von Nebenwirkungen, Ziel, die erschweren oder sogar verschleiern Interpretation der experimentellen Ergebnisse könnten. Lokale Gentherapie gezielt Gefäßendothels, wie in diesem Manuskript beschrieben könnte systemischen Nebenwirkungen vermeiden, denn der infundierte Vektor nicht weit über die transduced arteriellen Segment verbreitet ist und lokale vaskuläre Effekte, ohne erzielt werden Änderungen im systemischen Plasmaspiegel von Protein. 27 darüber hinaus ein weit geringer Betrag des Vektors muss eine arterielle Segment transduzieren als erforderlich, um robuste hepatische Transduktion zu erreichen. Transgene Ausdruck aus der Leber wurde berichtet, zu sinken im Laufe der Zeit wahrscheinlich aufgrund der Zellerneuerung, die wiederholter Gabe, wenn hochrangige Transgene Ausdruck soll beibehalten werden. 28 im Gegensatz dazu bietet die niedrige Fluktuationsrate des Endothels stabile Expression für mindestens 48 Wochen in Chow gefütterten Kaninchen und mindestens 24 Wochen bei atherosklerotischen Läsionen des Cholesterin-gefütterten Kaninchen. 1 , 27
Um festzustellen, ob diese Methode des Gentransfers auf gemeinsame Halsschlagader Endothel Kaninchen geeignet ist, sollten die vor- und Nachteile (Tabelle 1) im Zusammenhang mit den spezifischen Forschungsziele betrachtet werden. Vorteile dieser Methode sind unter anderem: fremd-Kaninchen sind bessere Vertreter der menschlichen genetischen Vielfalt als Inzucht Mäuse (wichtig für präklinische Arbeit); Kaninchen, größere Schiffe für einfachere Handhabung und mehr Gewebe für die Analyse bereitzustellen; die Methode kann Endothel gezielt Transgen Ausdruck erreichen sehr viel schneller als Keimbahn endotheliale targeting bei transgenen Mäusen tut; Vektor-Dosis kann leicht zu einer Variable Transgene Ausdruck Modell eingestellt werden; speziell für große Arterie Endothel Prozesse untersucht werden können; und lokale vaskuläre Transgenese ermöglicht dem gegenüberliegenden Carotis im gleichen Tier als ein Steuerelement, systemische Faktoren als unkontrollierte Variablen verwendet werden. Nachteile sind: spezielle Einrichtungen und Fachkenntnisse sind erforderlich; weniger gentechnisch veränderte Hintergründe auf dem Experimentieren gibt es bei Kaninchen als bei Mäusen; und es gibt eine weniger umfangreiche Auswahl von Antikörpern gegen Kaninchen gegen Maus-Proteine (für Immunodetection des Transgens Protein und andere Antigene, die möglicherweise wichtig bei der Interpretation der Versuchsergebnisse).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:888px;" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Disposables</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">3mL syringe with 24G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309571</td>
			<td style="width:199px;">2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">1mL syringe with 27G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309623</td>
			<td style="width:199px;">6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">20mL syringe, luer lock</td>
			<td>Nipro Medical Corp</td>
			<td>JD+20L</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Catheters, 24G x 3/4&#34;</td>
			<td>Terumo Medical Products</td>
			<td>SROX2419V</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">19G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305187</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">21G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305165</td>
			<td style="width:199px;">For 20 mL syringe of saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Gauze 4&#34; x 4&#34;</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td style="width:149px;">3242</td>
			<td style="width:199px;">~10-15 per surgery</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">3-0 silk suture</td>
			<td>Covidien Ltd.</td>
			<td>S-244</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">5-0 silk suture</td>
			<td>Covidien Ltd.</td>
			<td>S-182</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">7-0 polypropylene suture</td>
			<td>CP Medical</td>
			<td>8648P</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">5-0 polyglycolic acid suture</td>
			<td>CP Medical</td>
			<td>421A</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">3-0 polyglycolic acid suture</td>
			<td>CP Medical</td>
			<td>398A</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Alcohol swabs</td>
			<td>Covidien Ltd.</td>
			<td>6818</td>
			<td style="width:199px;">For placement of I.V. line</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Catheter plug</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>411498</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Ketamine HCl, 100 mg/mL</td>
			<td>Vedco Inc.</td>
			<td>05098916106</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>4821</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Lidocaine HCl, 2%</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00409427702</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Bupivacaine HCl, 0.5%</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00409161050</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Beuthanasia D-Special</td>
			<td>Intervet Inc.</td>
			<td>NDC 00061047305</td>
			<td style="width:199px;">Harvest surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>12496075705</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Saline IV bag, 0.9% sodium chloride</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1309</td>
			<td style="width:199px;">2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Heparin&#160; (5000 U/mL)</td>
			<td>APP Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 63323-047-10</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Fentanyl patch, 25 mcg/hr&#160;</td>
			<td>Apotex Corp.</td>
			<td>NDC 60505-7006-2</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Isoflurane</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td style="width:149px;">Catalog number not available</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:359px;">Gene transfer vector</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:199px;">Dilute 350 &#181;L per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Metzenbaum needle holder 7&#34; straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-7900</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Operating scissors 6.5&#34; straight blunt/blunt</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-6828</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Needle holder /w suture scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td style="width:149px;">8-14-IMC</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Castroviejo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5658</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Castroviejo needle holder, 5.75&#34; straight with lock</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-6412</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Stevens scissors 4.25&#34; curved blunt/blunt</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-5943</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Alm retractor 4&#34; 4X4 5mm blunt prongs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-6514</td>
			<td style="width:199px;">2x</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Backhaus towel clamp 3.5&#34;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:199px;">4x</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Micro clip setting forceps 4.75&#34;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-6496</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Micro vascular clips, 11 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:199px;">2x for gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Surg-I-Loop</td>
			<td>Scanlan International</td>
			<td style="width:149px;">1001-81M</td>
			<td style="width:199px;">5 cm length</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Bonaccolto forceps, 4&#8221; (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-5210</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-5042</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Graefe forceps, 4&#8221; (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-5280</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Halstead mosquito forceps,&#160; 5&#34; straight, 1.3mm tips</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-7110</td>
			<td style="width:199px;">2x</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Halstead mosquito forceps,&#160; 5&#34; curved, 1.3mm tips</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-7111</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Jacobson mosquito forceps 5&#34; curved extra delicate, 0.9 mm tips</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-7117</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Kantrowitz forceps, 7.25&#34; 90 degree delicate, 1.7 mm tips</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-7305</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Tissue forceps 5&#34;, 1X2 teeth, 2 mm tip width</td>
			<td>Roboz</td>
			<td style="width:149px;">RS-8162</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11092-12</td>
			<td style="width:199px;">2x</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Adson forceps, 12 cm, serrated, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11006-12</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Veterinary electrosurgery handpiece and electrode</td>
			<td>MACAN Manufacturing</td>
			<td style="width:149px;">HPAC-1; R-F11</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Surgical Suite Equipment</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Circulating warm water blanket and pump</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td style="width:149px;">Catalog number not available</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Forced air warming unit</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:149px;">Bair Hugger Model 505</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">IV infusion pump</td>
			<td>Heska</td>
			<td style="width:149px;">Vet IV 2.2</td>
			<td style="width:199px;">Gene transfer surgery only</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Isoflurane vaporizer and scavenger</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td style="width:149px;">Catalog number not available</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Veterinary multi-parameter monitor</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td style="width:149px;">Surgivet Advisor</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Veterinary electrosurgery unit</td>
			<td>MACAN Manufacturing</td>
			<td style="width:149px;">MV-9</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Surgical microscope</td>
			<td style="width:181px;">D.F. Vasconcellos</td>
			<td style="width:149px;">M900</td>
			<td style="width:199px;">Needs ~16x magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo gene transfer to the rabbit common carotid artery endothelium

Das Ziel dieser Methode ist, ein Transgen in das Endothel der isolierte Segmente der beiden Kaninchen gemeinsame Halsschlagadern einzuführen. Die Methode erreicht fokale endotheliale selektive Transgenese, wodurch ein Ermittler um die biologische Rollen von endothelialen ausgedrückt transgenen zu ermitteln und zu quantifizieren, die in-vivo transkriptionelle Aktivität der DNA-Sequenzen in große Arterie Endothelzellen. Die Methode verwendet chirurgische Isolation von Kaninchen gemeinsame Halsschlagadern und eine arteriotomie Transgen exprimierenden viralen Vektoren in das arterielle Lumen liefern. Eine kurze Inkubationszeit des Vektors in das Lumen mit nachfolgenden Aspiration des Inhalts Lumen ist ausreicht, um effizienter und langlebiger Expression des Transgens in das Endothel ohne nachweisbare Transduktion oder Ausdruck außerhalb der isolierte arterielle Segment. Die Methode erlaubt Einschätzung der biologischen Aktivitäten des Transgens Produkte sowohl in normalen Arterien Modelle menschlicher vaskulären Erkrankungen, unter Vermeidung von systemischen Wirkungen, die entweder durch gezielte gen Lieferung zu anderen Websites (zB. verursacht werden könnten der Leber) oder durch den alternativen Ansatz genetischen Konstrukte des Endothels durch Keim Linie Transgenese zu liefern. Anwendung der Methode wird durch die Notwendigkeit eines erfahrenen Chirurgen und Anästhesisten, einen gut ausgestatteten Operationssaal, die Kosten für Kauf und Gehäuse Kaninchen und den Bedarf an Fachwissen in Gentransfer Vektor Bau und die Nutzung begrenzt. Mit dieser Methode erzielten Ergebnisse gehören: Transgen-im Zusammenhang mit Veränderungen im arteriellen Struktur, zellularität, extrazelluläre Matrix oder vasomotorische Funktion; zu- oder Abschläge bei arteriellen Entzündungen; Veränderungen im Kreislauf zellapoptose; und Progression, Retardierung oder Regression von Krankheiten wie Intima-Hyperplasie oder Arteriosklerose. Die Methode erlaubt auch Maß für die Fähigkeit der native und synthetische DNA regulatorischen Sequenzen zum Ändern Transgene Ausdruck in Endothelzellen, die Ergebnisse, die zählen: Ebenen des Transgens mRNA Niveaus des Proteins Transgen und Ebenen des Transgens enzymatische Aktivität.

Zur Umsetzung dieser Methode vertrauensvoll sind Vorversuchen notwendig, um festzustellen, ob der Betreiber effiziente und reproduzierbare Gentransfer mit Transgene Ausdruck vor allem in der luminalen endothelial Zellen erreicht. Nach unserer Erfahrung ist dies am einfachsten anhand eines Vektors, das β-Galaktosidase ausdrückt. 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) Färbung der gemeinsame Halsschlagader Segmente entfernt 3 Tage nach Vektor Infusion sowie Messung der ...

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In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

Diese Methode ist ein Transgen in das Endothel der Kaninchen Halsschlagadern einzuführen. Einführung des Transgens ermöglicht die Beurteilung der biologischen Rolle der Transgen-Produkt entweder normale Arterien oder Krankheitsmodelle. Die Methode eignet sich auch zur Messung der Aktivität der regulatorischen DNA-Sequenzen.

In Vivo Gentransfer in die Kaninchen gemeinsame Halsschlagader Endothel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

The overall goal of this surgical procedure is to introduce a transgene into the endothelial cells of rabbit carotid arteries. This method helps answer questions in vascular biology and gene therapy about the roles of arterial wall transgene products and the roles of DNA-regulatory sequences in controlling transgene expression. This technique allows the efficient expression of transgenes within a focal segment of the vascular endothelium, allowing the site-specific study of the biological roles of endothelial-expressed genes.Generally, individuals new to this method will struggle as new investigators often puncture back wall of the artery and do not tie off all of the small side branches. After confirming a lack of response to toe pinch, apply ointment to the animal's eyes and shave both ears and the left-rear middle toe. Insert a 24 gauge IV catheter into the left ear vein and apply a fentanyl patch to the right ear.Shave the anterior neck from the sternal notch to the edge of the mandible. Place the rabbit in the supine position on the operating table with a rolled neck support towel just below the animal's head. Gently extend the rabbit's neck until it is straight and approximately horizontal.To begin the surgery, use electrocautery to cut the skin approximately seven to nine centimeters along the midline. Clamp the tissue open with towel clamps and make a short lateral cut through the fascia with the electrocautery. Insert large scissors into the cut to bluntly dissect the fascia along the midline and cut through the dissected fascia with the electrocautery device.Beginning on the right side, use small dissecting scissors to dissect between the V-shaped sternocephalic muscles and the sternohyoid muscle over the trachea to expose the common carotid arteries. Dissect the right common carotid artery from the surrounding tissues from the base of the neck caudally to the crossing of the pharyngeal nerve cranially and use surgical silicon loops to aid in the retraction of the artery. Ligate any branches coming off of each side of the common carotid artery with 5-0 silk sutures.Then cut each branch distally one to two millimeters away from the sutures to free a four to five centimeter segment of the carotid. Next, move a surgical microscope into position and drape a sterile towel over the microscope to allow manipulation of the microscope without contaminating the sterile field. Place two silk ties, each with a loose overhand knot, around the midportion of the mobilized carotid segment.Place a vascular clip at the cranial end of the isolated artery segment to allow the artery to fill, then place a vascular clip at the caudal end of the artery. Using a 19 gauge needle bent just above the bevel at an approximately 80-degree angle, puncture the artery just cranial to the caudal vascular clip, taking care not to puncture the back or side walls of the vessel. Advance the needle tip into the lumen, withdrawing the tip twice to make sure the arteriotomy completely traverses the artery wall before carefully withdrawing the needle completely.Next, bend an IV catheter about four millimeters from the tip to an approximately 75-degree angle and loosely attach the IV catheter to a syringe filled with sterile tissue culture medium. Insert the catheter into the artery up to the bend point and fill the artery with 250 microliters of medium, then gently press with a gloved finger along the artery from just caudal to the cranial vascular clip to the arteriotomy to flush out the medium. After a second wash as just demonstrated, tighten the two silk sutures around the catheter tip to seal the lumen and attach a syringe containing the virus solution to the catheter.Gently depress the syringe plunger to infuse 250 microliters of the virus until the artery is distended to its physiological caliber and gently lay the syringe on a nest of gauze for support. Place a 7-0 polypropylene suture in the common carotid adventitia just caudal to the cranial vascular clip to mark the cranial boundary of gene transduction. After 20 minutes, replace the virus-containing syringe with an empty syringe and gently aspirate the virus-containing solution until the vessel collapses.Then remove the syringe, silk ties, and catheter. Using 7-0 polypropylene suture, make a loose X-pattern across the arteriotomy. Very briefly release the cranial vascular clip to flush the artery of any air or residual virus and tighten the suture.Release the cranial and caudal vascular clips using light pressure and gauze to stop any bleeding and close the midline fascia with a continuous suture, then close the skin with an intradermal pattern with buried knots at both ends. To harvest the transduced carotid arteries at the appropriate experimental endpoint, use 3-0 silk suture to ligate the common carotid artery cranially and caudally to the segment infused with the vector. The 7-0 suture placed in the adventitia marks the cranial end and the arteriotomy marks the caudal end.Excise the carotid segment between the ligations and flush the lumen with saline. Then trim away any excess adventitia and cut the transduced carotid segment into smaller pieces for the appropriate experimental endpoint analyses. En face images of the lumenal surfaces of rabbit common carotid arteries infused with adenovirus expressing beta-galactosidase demonstrate a robust endothelial staining with X-gal.Axial images of the lumenal surfaces of intact carotid rings reveal X-gal staining primarily on the lumenal surface. X-gal staining is also observed primarily in the endothelial cells of axially-opened vessels, although a small amount of staining is found in the adventitial layer. Analysis of RNA extracted from the vessel segments reveals substantial over-expression of transgenes relative to their endogenous levels, with considerable intra-and inter-artery variability in transduction efficiency and transgene expression observed among arteries transduced by experienced operators.Once mastered, the rabbit common carotid artery gene transfer surgical procedure can be completed in less than two hours. Following this procedure, RT-PCR, immunohistochemistry, Western blotting, or other methods can be performed to answer questions about the role of DNA-regulatory sequences in altering transgene expression and the role of transgene products within the artery wall. After its development, this technique paved the way for the study of gene therapy in treatment of vascular diseases such as arterial atherosclerosis and of vein graft disease.Don't forget proper bio-safety precautions should always be taken when working with viral vectors and sharp objects.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Ein Modell des Disturbed Flow-Atherosklerose in Maus Halsschlagader durch partielle Ligation und eine einfache Methode zur RNA-Isolierung aus Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Forschung

Medizin

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Trainieren eines Sophisticated mikrochirurgische Technik: Interposition der Vena jugularis externa Graft in der Arteria carotis communis bei Ratten

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion als adäquate Vorbehandlung Stimulus zu frühe ischämische Toleranz zu Focal zerebraler Ischämie induzieren

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Ein Mausmodell der Stentimplantation in der Arteria carotis für das Studium der Restenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

Erwachsene Maus venöse Bluthochdruckmodell: A. carotis communis, um äußere Jugularvene Anastomose.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gentransfer-Technik und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Gefäßballon Verletzung und intraluminale Verwaltung in Rattenhalsschlagader

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Darstellende Permanent Distal cerebri mit Arteria carotis communis Occlusion bei alten Ratten zu studieren kortikale Ischämie mit anhaltenden Behinderungs

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...