Name: primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Denna studie finansierades delvis av BrightFocus Foundation (till DS).

Förfaranden som omfattar animaliska ämnen har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Pittsburgh
1. Förbered lösningar
<ol><li>Förbereda odlingsmedium genom komplettering Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM), hög glukos med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, 2,5 mM L-glutamin och 1 x MEM onödiga aminosyror. Pre varma media i 37 ° C inkubator före användning.</li>
	<li>Förbered 2% (wt/vol) dispase ...

<ol>
	<li>Mart&#237;nez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development:+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium.">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li><li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells:+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations.">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li><li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium.">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li><li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells.">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li><li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models.">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li><li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+(RPESC).">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li><li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+culture;a+potential+source+of+retinal+stem+cells.">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li><li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes.">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li><li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling.">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li><li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin,+complex+1+signaling.">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li><li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation.">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique.">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li><li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers.">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li><li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa,+the+Usher+syndrome+1B+protein.">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li><li>Pitk&#228;nen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+retinal+pigment+epithelium:+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity.">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li><li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture.">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li></ol>

Det presenteras detaljerade protokollet möjliggör tillförlitlig inrättandet av mus primära RPE kulturer som når konfluens efter 1 vecka och presentera de viktigaste RPE egenskaperna såsom sexkantig form och pigmentering efter 2 veckor. De erhållna RPE-cellerna kan användas för ett antal nedströms tillämpningar såsom vitamin A metabolism9, fagocytos av ljusmätare yttre segment10 och ion transport11, epitelial cell polaritet<sup class="xr...

Retinal pigmentepitel (RPE) är ett enda lager av polariserade epitelceller som ligger mellan neurala näthinnan och åderhinnan i ögat. Funktionaliteten i RPE-cellerna och integriteten hos de RPE enskiktslager är kritiska för vision eftersom RPE spelar en viktig roll i flera processer såsom att upprätthålla den yttre blod-retinal barriären, transport av vatten och joner mellan näthinnan och koroidea, ljus absorbering, skydd mot oxidativ stress, kontroll av retinoid metabolism och fagocytos av de yttersta segmenten av fotoreceptorer1,2. Placeringen av RPE på baksidan av ögat, liksom dess barriärfunktion förebyggande läkemedel administreras systemiskt från passera från blodet till glaskroppen, gör det svårt att studera komplexiteten av RPE funktion i vivo. Det finns således ett stort behov för etableringen av RPE cellkulturer att studera RPE-cellerna i en flexibel och kontrollerad miljö3,4.
Finns ett antal etablerade RPE-cellinjer, som ger ett enkelt och bekvämt sätt att erhålla och lagra cellerna; överförda celler har dock vissa nackdelar jämfört med primära celler2,3,4. Först, de kännetecknas ofta av förändringar i cellmorfologi. Till exempel befanns ingen av de existerande cellinjer vara lämplig för en tillförlitlig studie av RPE barriäregenskaper på grund av förlusten av cell polaritet fenotyp och delvis försvinner i åtsittande föreningspunkter4. Förutom förlusten av polaritet och rätt cell till cell anslutningar förlora RPE cellinjer snabbt sin pigmentering på grund av avsaknad av viktiga Melanogenes enzymer i de vuxna RPE-5. Pigmentering kan återställas, men den omfattande analysen av mekanismen för re-pigmentering som skulle innehålla en kombination av transmissionselektronmikroskopi, gen uttryck analys och kemiska analyser till förekomsten av melanin har aldrig varit utförda6. En ytterligare begränsning är att raderna RPE cell har utökade cell liv (ibland - odödlighet) och under vissa förutsättningar kan omvandla till själv förnya multipotenta stamceller som kopplar loss från underlaget och bildar flytande kolonier7, 8. denna begränsning gör det omöjligt att använda cell linjer för transplantation experiment3.
Med tanke på nackdelarna av RPE etablerade cellinjer, primära RPE cellkulturer från färska vävnader kan fungera som en mer biologiskt relevant modell för att studera RPE. Primära RPE-celler har använts inte bara att studera RPE-specifika funktioner såsom vitamin A metabolism9, fagocytos av ljusmätare yttre segment10 och ion transportera11, men också att studera grundläggande cellbiologi som epitelial cell polaritet2 , lysosomala homeostas och autofagi12,13.
Under de senaste åren har förekommit ett antal publikationer om inrättande av primära RPE kulturer, vilket tyder på ett växande intresse för detta område forskning3,14,15. Många protokoll för mänskliga RPE-celler och icke-mänskliga RPE-celler såsom bovin och porcin RPE-celler var publicerade16,17,18,19. Det är dock svårare att hantera musen RPE-celler på grund av deras mycket mindre storlek. Även om ganska ett antal publikationer har beskrivit protokoll för att isolera RPE-celler från mus14,20,21, finns det fortfarande många forskare kämpar för att isolera RPE-celler utan förorening av koroidea celler eller celler från neural retina skräp. Här presenterar vi protokollet för att skapa primära mus RPE cellkultur, inklusive att få ögonen från mus, dissekering av ögonen och isolering av RPE täcker ge cellerna för odling. Denna video protokollet skulle vara särskilt användbar för forskare som börjar arbeta med mus primära RPE kulturer och behöver vägledning på dissektion teknik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="980">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">animals</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:388px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">2~3-week old wildtype mice</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Name</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">reagents</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dispase II</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Cellgro</td>
			<td style="width:123px;">61-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">KOH</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM9759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethyl Alcohol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:38px;width:347px;">RPE65 antibody</td>
			<td style="width:123px;">A gift from Dr. Michael Redmond</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fluorescein Phalloidin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">F432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A11011&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:123px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:123px;">00380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:38px;width:347px;">ZO-1 Polyclonal Antibody</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Name</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">instruments and equipments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Laminar flow cabinet</td>
			<td style="width:123px;">Baker</td>
			<td style="width:123px;">SterilGARD SG403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">CO2 incubator with hot air sterilization</td>
			<td style="width:123px;">Binder</td>
			<td style="width:123px;">C150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td style="width:123px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:123px;">COR-3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td>
			<td style="width:123px;">STEPHENS instruments</td>
			<td style="width:123px;">S7-1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td>
			<td style="width:123px;">Stroz Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:123px;">E1796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Crescent straight knife</td>
			<td style="width:123px;">Beaver-Visitec International</td>
			<td style="width:123px;">373808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Vannas Scissors, 8 cm, 45&#176; Angle, Standard</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">500260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGL0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Syringe, 5 mL</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Inverted Laboratory Microscope&#160;Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:123px;">&#160;Leica&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipette</td>
			<td style="width:123px;">Gilson</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Barrier and non-filtered pipette tips</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

Retinal pigmentepitel (RPE) är en starkt polariserad multifunktionella epitel som ligger mellan neurala näthinnan och åderhinnan i ögat. Det är ett enstaka pappersark pigmenterade celler som hexagonally packas och ansluten med tight junctions. De viktigaste funktionerna i RPE inkluderar absorption av ljus, fagocytos skjul ljusmätare yttre segment, rumsliga buffring av joner, transport av näringsämnen, joner och vatten samt aktivt deltagande i den visuella cykeln. Med sådana viktiga och olikartade funktioner är det kritiskt viktigt att studera biologi av RPE-celler. Ett antal RPE cellinjer har fastställts. dock är anpassade och förevigade celler kända för att snabbt förlora vissa morfologiska och fysiologiska egenskaper av naturliga RPE-celler. Primära celler är således mer lämpade för att studera olika aspekter av RPE cellbiologi och funktion. Mus primära RPE cellkultur är mycket användbart för forskare eftersom musmodeller används ofta i biologiska studier, emellertid samla RPE-celler från mus är också mycket utmanande på grund av sin ringa storlek. Här presenterar vi ett protokoll för att skapa primära mus RPE cellkulturer som omfattar enucleation och dissektion av ögonen och isolering av RPE täcker ge cellerna för odling. Denna metod möjliggör effektiv cell återvinning. RPE-cellerna erhållits från två möss kan nå konfluens på en 12 mm polyester membran infoga förinstallerad i kultur plattan efter en vecka av kultur och visa några av den ursprungliga egenskaper hos bona fide RPE-celler såsom sexkantig form och pigmentering efter två veckor av kultur.

Mus RPE primärkulturen etablerad från 2 möss i 12 mm polyester membran infoga når 90-95% konfluens efter 1 vecka i kultur. Efter 2 veckor av kultur, celler nådde 100% konfluens och började att bilda en mosaik av sexkantiga, pigmenterad och bi-nucleated celler. Med 3 veckor av kultur, cellerna fortsatte att bilda formen och pigmentering, men fick efter 4 veckor en del av cellerna hyperpigmenterad (figur 2).
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Retinal pigmentepitel (RPE) är en multi-funktionell epitel i ögat. Här presenterar vi ett protokoll för att upprätta primära cellkulturer härrör från murina RPE.

Primära cellkulturer från mus Retinal pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primär Neuronal kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

Primär dissocierade mitthjärnan Dopamin cellkulturer från Gnagare Nyfödda

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv dissekering och kultur av primära mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Nitroreduktas/metronidazolmedierad ablation och en MATLAB-plattform (RpEGEN) för att studera regenerering av zebrafiskens retinala pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primär odling av svin retinala pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering av primära musretinala pigmenterade epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv och konsekvent generering av retinal pigmentepitel / choroid flatmounts från mänskliga ögon för histologisk analys

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...