18.6K Views
•
10:35 min
•
October 3rd, 2018
DOI :
October 3rd, 2018
•0:04
Title
0:37
Embryo Fixation
1:48
Embryo Sorting
3:07
In Situ Hi-C - Lysis
4:57
In Situ Hi-C - Digestion, Overhang Fill-in, and Ligation
6:58
DNA Extraction
9:11
Results: Analysis of Chromatin Conformation Capture Libraries from Drosophila Embryos
9:58
Conclusion
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for kromatinarkitektur, såsom hvordan 3D-strukturen af kromatin kan påvirke genekspression og udvikling. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en høj opløsning opfattelse af kromatin arkitektur og præcist iscenesat flyve embryoner. Selv om denne metode kan give indsigt i kromatin organisation og udvikling, kan man også bruge eksisterende linjer fra transgene flyve biblioteker til at teste deres virkning i kromatin organisation.
For at begynde protokollen justeres det samlede volumen af tidligere indsamlede embryoner til to milliliter med PBST. Tilsæt seks milliliter heptan og 100 mikroliter af 37% formaldehyd i vand. Efter tilsætning af formaldehyd rystes røret kraftigt op og ned i et minut.
Den vandige og organiske fase vil kombinere til at danne en shampoo-lignende konsistens. Omrør blandingen på en roterende mixer i 10 minutter. Centrifuge røret ved 500 gange g i et minut ved stuetemperatur for at indsamle embryoner i bunden af røret.
Aspirere hele shampoo-lignende væske og kassér det, passe på ikke at aspirere nogen embryoner. 15 minutter efter tilsætning af formaldehyd opsalted embryonerne i fem milliliter PBST med 125 millimolar glycin. Ryst embryonerne op og ned kraftigt i et minut.
Efter centrifugering, aspirere supernatant. Ved hjælp af en 1.000 mikroliterpipette overføres et parti på 100 embryoner til et lille glasbeholder, der er egnet til sortering, helst på en mørk baggrund, og læg den på is. Sorter embryoner efter nuklear tæthed og cellecyklusstatus ved hjælp af en nål eller sprøjtespids.
Fjern alle mitotiske embryoner, der kan genkendes ved deres spredte, ikke-nukleare distribution af EGFP PCNA og embryoner, der delvis viser et ikke-nukleart GFP-signal. For at hjælpe med sorteringen skal referenceembryoner i nukleare cyklusser 12, 13 og 14 i hvert parti suppleres med et af referenceembryonerne. Pipette op de ønskede embryoner ved hjælp af en 1,000 mikroliter pipette.
Overfør dem til et frisk rør og læg dem på is. Fortsæt, indtil der er sorteret nok embryoner til det planlagte eksperiment. Spin rør kort ved 100 gange g ved stuetemperatur.
Fjern supernatanten og sørg for, at embryonerne er så tørre som muligt til frysning. Flash fryse embryoner ved nedsænkning rørene i flydende nitrogen og opbevares på minus 80 grader Celsius. Anslør rørene med frosne embryoner på is.
Opslæned embryonerne i 500 mikroliter af iskold lysis buffer. Vent et minut til at lade fosteret til at bosætte sig i bunden af røret. Dernæst male embryoner med en metal mikro støder forkølet på is, der er designet til stramt at passe en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.
For at undgå at omrøre embryonerne skal du sætte støderen langsomt ind, indtil den rører ved bunden af røret. Tryk ned og derefter male ved at dreje støderen to gange i begge retninger. Løft støderen meget lidt.
Tryk ned på bunden af røret igen, og gentag slibeproceduren 10 gange, eller indtil embryonerne er helt lyset. Opløsningen skal være homogen, og der bør ikke være rester af store stykker embryoner tilbage. Den homogeniserede affjedring skal indøses på is i 15 minutter.
Spin ved 1, 000 gange g fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten og vask pellet ved resuspending i 500 mikroliter iskold lysis buffer og pipettering op og ned. Efter endnu et spin skal supernatanten kasseres.
Opsalt den vaskede pellet i 100 mikroliter af 0,5% Natrium Dodecyl sulfat eller SDS. Derefter permeabilize kernen ved at inkubere prøven i 10 minutter ved 65 grader Celsius i en varmeblok. Tilsæt 50 mikroliter af 10% Triton X100 og 120 mikroliter vand.
Svirp røret til at blande indholdet og inkubere røret ved 37 grader Celsius i 15 minutter i en varmeblok. Der tilsættes 25 mikroliter med 10X enzymbuffer og 20 enheder på fem enheder pr. mikroliter MBO1. Svirp røret for at blande indholdet og inkubere røret i en varmeblok for at fordøje DNA'et.
Tilføj yderligere 20 enheder af MBO1. Fortsæt inkubationen i 90 minutter. Efter den anden 90-minutters inkubation inkuberes prøven ved 62 grader Celsius i 20 minutter for at inaktive MBO1.
Dernæst tilsættes 18 mikroliter på 0,4 millimolar biotin 14-dATP, 2,25 mikroliter af en umodificeret 3,3 millimolar dCTP-dGTP-dTTP mix, og otte mikroliter af fem enheder pr mikroliter DNA polymerase I Klenow fragment. Svirp røret for at blande indholdet og inkubere prøven ved 37 grader Celsius i 90 minutter. Dernæst tilsættes 657 mikroliter vand, 120 mikroliter af 10X T4 DNA ligase buffer, 100 mikroliter på 10% Triton X100, seks mikroliter på 20 mg pr. milliliter kvæg serum albumin, og endelig fem mikroliter af fem enheder pr microliter T4 DNA ligase.
Drej derefter forsigtigt røret ved 20 omdr./min. ved stuetemperatur i to timer. Tilføj yderligere fem mikroliter af fem enheder pr mikroliter T4 DNA ligase. Fortsæt med at rotere i yderligere to timer, drej derefter ned i kernerne ved 2, 500 gange g i fem minutter.
Efter centrifugering kasseres supernatanten. Opslæm pellet i 500 mikroliter af ekstraktion buffer og tilsæt 20 mikroliter af 20 milligram per milliliter proteinase K.Flick røret og inkubere røret til at fordøje protein. Der tilsættes 130 mikroliter af fem molarnatriumchlorid og inkuberes natten over til de-crosslink.
Den næste dag, pipette prøven i en ny to milliliter rør med lav DNA bindende egenskaber. Tilføj 0,1 X volumen af tre molar natriumacetat og to mikroliter på 15 milligram per milliliter GlycoBlue. Der tilsættes 1,6 volumener ren absolut ethanol, og indholdet inverteres, derefter inkuberes prøven ved minus 80 grader Celsius i 15 minutter.
Efter inkubation, centrifuge indholdet. Find DNA-pellet, som kun kan ses af GlycoBlue. Fjern supernatanten forsigtigt og flyttede pipetåsen ind i røret langs den modsatte væg fra DNA-pellets.
Vask pellet med 800 mikroliter på 70% ethanol. Prøven blandes ved at vende den og centrifuge den ved 20.000 gange g ved stuetemperatur i fem minutter. Fjern de resterende dråber under dette trin, og følgende vasker ved at skubbe dem ud af rørene med en P10 spids, derefter åbne låget til luft tør i op til fem minutter.
Når der ikke er væske tilbage, tilsættes 50 mikroliter af 10 millimolar trischlorid. Gentagne gange pipette opløsningen over det område, hvor pellet var placeret for at opløse DNA. Tilføj en mikroliter på 20 mg pr. milliliter RNase A.Mix ved at svippe røret.
Inkuber prøven ved 37 grader Celsius i 15 minutter for at fordøje RNA. Endelig opbevares prøven i fryseren eller køleskabet, indtil biblioteket forberedes. Billeder af EGFP PCNA-signalet fra hvert sorteret embryonparti afslører præcise fase- og cellecyklusstatusser for hvert enkelt embryon til downstream-forsøg.
Bioanalyzer spor viser, at størrelsen fordelingen af DNA fragmenter efter størrelse udvælgelse er mellem 300 til 700 base par med et maksimum på omkring 450 base par. Hi-C interaktion kort viser, at på nukleare cyklus 12, få Topologisk Associerede Domæner eller TADs opdages, som ændrer sig dramatisk på nukleare cyklusser 13 og 14, når TADs bliver stadig mere fremtrædende og uspecifik langtrækkende kontakter er opbrugt. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at vaske perlerne grundigt og ikke at forlænge inkubationstiderne unødigt især ved høje temperaturer, da dette kan føre til hi-C-biblioteker af lav kvalitet.
Denne teknik kombinerer nøjagtig iscenesættelse og høj opløsning kromatin bekræftelse kortlægning banede vejen for forskere inden for epigenetik til at udforske den rolle, som tre-dimensionelle kromatin organisation i en in vivo udviklingsmæssige indstilling.
Dette arbejde beskrives en protokol for generation af høj opløsning i situ Hi-C biblioteker fra stramt iscenesat præ gastrulation Drosophila melanogaster embryoner.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved