Name: laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور مارتن م. شميت وخط فرايموهس. هذا العمل كان تدعمه "مؤسسة هولندا" "البحث العلمي" (زونمو على 016.126.358 اندشتاينر مؤسسة بحوث نقل الدم (Nr. 1638) والألمانية الأوقيانوغرافية (SFB1123/A2) منحت إلى R.R.K.

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها الأخلاقية الطبية ومجالس الأخلاقية الحيوان في جامعة ماستريخت.
1-تدفق على أساس مقايسة مع الخلايا البشرية
<ol><li>
عزل الصفائح الدموية من الدم البشري
	<ol>
<li>سحب الدم الوريدي في تخثر سترات (3.2 في المائة).</li>
		<li>إضافة إلى حجم 1/15 من "حمض سترات ?...

<ol>
	<li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function.">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis.">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li><li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury.">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li><li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice.">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li><li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb&#945;.">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIb&#945;.</a> Nature communications. 8, 15559 (2017).</li><li>Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS-based+microfluidic+devices+for+biomedical+applications.">PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications.</a> Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).</li><li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+shear+viscosity+and+shear+rate+from+pressure+drop+and+flow+rate+relationship+in+a+rectangular+channel.">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).</li><li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis.">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li></ol>

هذا التحليل في المختبر وسيلة مباشرة للتحقيق في الآليات الأساسية للتوظيف الكريات البيض أثناء التهاب الأوعية الدموية، ولكن هناك بعض النقاط الحرجة للإشارة إلى. الشرط الأول لنجاح إجراء هذا الفحص هو نضح من الكريات البيضاء حالها والمتلاقية الأوعية الدموية أو أحادي الطبقة الصفائح الدموي?...

عند الإصابة أو الالتهاب أو العدوى، الكريات البيضاء بسرعة الاستجابة الممرض أو الأضرار-المرتبطة بالجزيئات أنماط (بامبس، دامبس)، تغيير في حالة نشطة، والانتقال من مجرى الدم إلى مواقع لتلف الأنسجة والتهاب. قدرة الكريات البيضاء على التفاعل مع بيئتها الخلوية والجزيئية ضروري لوظيفتها الصحيحة كالخلايا المناعية، كما أبرزت الاضطرابات الوراثية مثل نقص التصاق الكريات البيض1. التصاق الكريات البيض خضعت لتحقيقات مكثفة خلال العقود الماضية وأسفر ذلك عن مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض في أوائل التسعينات2،3. التصاق الكريات البيض تبدأ بإلقاء القبض على سيليكتين بوساطة الكريات البيضاء إلى البطانة، مما تسبب في الخلايا للفة فوق سطح الأوعية الدموية. هذا المتداول تمكن الكريات البيضاء المسح الضوئي لربط البطانة المهاجرة العظة، مثلاً، المستقطبات، والحث على تفعيل إينتيجرينس. وفي وقت لاحق، التوسط integrins المنشط الربط إلى يغاندس بطانية، أسفرت عن اعتقال الكريات البيض وطيد. في وقت لاحق قد تعد الكريات البيضاء اكسترافاساتي بالزحف والانتشار، قبل اختراق أحادي الطبقة البطانية وترانسميجراتينج إلى الأنسجة الكامنة. المفهوم الأساسي لسلسلة الكريات البيض المتعارف عليه قد يتغير إلى حد كبير منذ إطلاقها، مع بعض الخطوات الوسيطة وأضاف4. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة وأدوار العديد من اللاعبين المتورطين في تجنيد الكريات البيض لم توضح حتى الآن، وتجنيد الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال الإصابة بالتهاب و (السيارات-) محصنة ضد البحث.
على سبيل المثال، أثناء أمراض التهاب الأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين، زيادة تجنيد الكريات البيض في وضع اللوحة محركات الأقراص الجدار السفينة. قد تمزق لويحات تصلب الشرايين غير مستقرة، مما يؤدي إلى تنشيط واسعة النطاق لنظام التخثر والصفائح الدموية، وفيما بعد انسداد السفينة5. قد ينتج هذا عن نتائج القلب والأوعية الدموية الشديدة مثل احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية. وباﻹضافة إلى ذلك، تعرية غشائي كما يحدث سريرياً، مثلاً بعد الدعامات للشريان التاجي، يؤدي إلى العديد من التفاعلات من الكريات البيضاء والصفائح الدموية إلى داخل الجدار سفينة مكشوفة (مثلاً، عناصر المصفوفة وسلس خلايا العضلات) والكريات البيضاء مع الصفائح الدموية تغطي إصابة الأوعية الدموية. هذه التفاعلات تعتبر هامة لمواصلة تطوير هذا المرض كما قد تدفع التفاعلات الوحيدات-الصفائح الدموية نيوينتيما تشكيل6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، توسط التفاعلات الكريات البيض الصفيحات الكريات البيض إنتغرين ماك-1 (α βم2) والصفائح الدموية GPIbα قد حددت مؤخرا كسائقين رواية تجلط الدم في الفئران8.
ونظرا لتوافر الدم البشري والحيواني على نطاق واسع كمصدر للكريات البيضاء والصفائح الدموية للبحوث، وطائفة واسعة من الجزيئات مصفوفة معزولة وخطوط الخلية مخلدة الكريات البيض ومنشأ الأوعية الدموية، أنه من الممكن لمحاكاة الكريات البيض التفاعلات تحت التدفق في مختبر للإعداد، باستخدام الدوائر نضح تدفق مصممة خصيصا. وقد صممت العديد من المتغيرات العقود الماضية، بدءاً من يحركها الفراغ إلى الدوائر نضح ذاتية اللصق. كافة المتغيرات تشترك في هذا الجزء غير متحركة (مثلاً، واستزراع خلايا الأوعية الدموية أو مصفوفة البروتينات) يتم تجميعها إلى غرفة مانعة للتسرب أكبر مزودة بقناة معرفة مسبقاً تمكين نضح السوائل فوق الجزء غير متحرك. وباﻹضافة إلى ذلك، مكن التقدم في صب التكنولوجيا وضع حلول مخصصة استناداً إلى السليكا البوليمرات9. اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة أساسا تحديد خصائص القص إجهاد الجهاز نضح تدفق10. في هذه المقالة، نقدم الأسلوب في المختبر لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، والتهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. استفادة الأساليب المقدمة هنا هو أنها يمكن أن يؤديها باستخدام مجهر الأسفار كاميرا متصلة مشتركة، ولا تتطلب من المجربون أن تمتلك الكفاءة التقنية العالية. الفحص في المختبر يمكن التلاعب بطرق عديدة (مثلاً، عن طريق إضافة مثبطات أو حجب الأجسام المضادة)، وهكذا قابلاً للتطبيق في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية ويسمح التحقيق في التصاق وظائف البروتين أو تقييم لمركبات معينة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:939px;" width="938">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies Europe bv</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Pump e.g. model: 210-CE</td>
			<td style="width:189px;">&#160;world precision instruments</td>
			<td style="width:163px;">78-9210W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:189px;">corning</td>
			<td style="width:163px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:189px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">300137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">228-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Elbow Luer Connector Male</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td style="width:163px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Female Luer Lock Coupler</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td style="width:163px;">10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:189px;">University Hospital RWTH Aachen</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&#246;mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&#228;ngen an Zelloberfl&#228;chen. 2005.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Ibidi sticky slide VI 0.4</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverslips for sticky slides&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td>Life Technologies Europe bv</td>
			<td style="width:163px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)</td>
			<td>Anaspec / Eurogentec</td>
			<td>24191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain</td>
			<td>Life Technologies Europe bv</td>
			<td>S7575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Hanks&#8217; Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>H4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES buffer solution 1M, liquid</td>
			<td>Life Technologies Europe bv</td>
			<td>15630049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BUMINATE Albumin, 25%&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Water for injection</td>
			<td style="width:189px;">B. Braun</td>
			<td style="width:163px;">3624315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:189px;">Merck</td>
			<td style="width:163px;">102382&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td style="width:163px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:189px;">Promocell GmbH</td>
			<td>C-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td style="width:189px;">Promocell GmbH</td>
			<td>C-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">&#160;PCS-100-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Vascular Cell Basal Medium&#160;</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Endothelial Cell Growth Kit-BBE</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Human endothelial cell line, EA.hy926</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">CRL-2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Human Monocytic cell line, THP-1</td>
			<td style="width:189px;">DSMZ</td>
			<td style="width:163px;">ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with Ultra-Glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Lonza</td>
			<td>BE12-702F/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Mouse monocyte/macrophage RAW264.7</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td style="width:189px;">Gibco</td>
			<td style="width:163px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">Accutase</td>
			<td style="width:189px;">Promocell GmbH</td>
			<td>C-41310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">Percoll</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">Histopaque 1119</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>11191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:420px;">10x PBS</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies Europe bv</td>
			<td style="width:163px;">14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:420px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin</td>
			<td style="width:189px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">367876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Greiner Bio</td>
			<td style="width:163px;">455322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:420px;">HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td style="width:163px;">Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets

تجنيد الكريات البيضاء عند الإصابة أو التهاب للمواقع من ضرر أو تلف الأنسجة حققت خلال العقود الأخيرة، وقد أدى مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض لا بعد تماما حددت. التوظيف الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال العدوى والتهاب (السيارات) محصنة والبحوث، فإننا نعرض تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، و التهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. يمكن استخدام التحليل في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية. ويصف هذا البروتوكول تحليل القائم على التدفق الصفحي استخدام دائرة التوازي-تدفق و مقلوب مجهر تباين المرحلة متصلة بكاميرا لدراسة التفاعلات بين الكريات البيضاء وخلايا بطانية أو الصفائح الدموية، التي يمكن أن تصور وتسجل ثم تحليل دون اتصال. يمكن pretreated خلايا بطانية أو الصفائح الدموية أو الكريات البيضاء مع مثبطات أو الأجسام المضادة لتحديد دور جزيئات محددة أثناء هذه العملية. شروط القص، أي الشرياني أو الوريدي القص الإجهاد، يمكن تكييفها بسهولة من اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة.

دراسة التصاق غشائي الكريات البيض، كانت perfused المسمى فلوريسسينتلي THP-1 خلايا أكثر TNFα-أو غير-حفز غشائي أحادي الطبقة لمدة 2 دقيقة في 3 داين/سم2. العدد الإجمالي للخلايا مونوسيتيك ملتصقة تحددها بعد 2 دقيقة من نضح التقاط 6 حقول مستقلة على مدى فترة من 2-6 دقيقة. تم قياس كمية الخل...

Watch this Scientific Journal Video about Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets at JoVE.com

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

القائم على التدفق الصفحي فحوصات للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على خلايا الأوعية الدموية مثقف والصفائح الدموية ملتصقة

الكريات البيضاء شوق تتفاعل مع خلايا الأوعية الدموية والصفائح الدموية بعد إصابة الجدار السفينة أو أثناء التهاب. وهنا يصف لنا تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لتوصيف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية.

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

The overall goal of this experiment is to investigate the mechanisms behind the interactions of leukocytes to adherent vascular cells or platelets under flow conditions. This method can help answer key questions in the immunology field such as how leukocytes are recruited to sites of inflammation. The main advantage of this technique is that it's cost effective, user friendly, and allows the investigation of a great variety of experimental conditions.This method can provide insight into leukocyte adhesion. It can also be applied to other systems such as the adhesion of tumor cells to immobilized cells or substrates under flow conditions. Demonstrating the procedure will be Annemiek Dickhout, an engineer and a PhD student working in my laboratory.After obtaining blood samples, add 1/15th volume of acid citrate dextrose to the blood. Next, centrifuge the blood sample by setting the brakes off at 350 times g for 15 minutes to obtain platelet-rich plasma. Then transfer the supernatant obtained to a 15 milliliter conical tube and add 1/10th volume of acid citrate dextrose to it.Again, centrifuge the suspension by setting the brakes off at 1, 120 times g for 15 minutes to obtain platelet-poor plasma. Next, discard the supernatant. Next, carefully resuspend the platelet pellet in platelet buffer maintained at pH 6.6 using a Pasteur pipette with a wide bore.Then add 1/10th volume of acid citrate dextrose to it and gently mix it. Next, centrifuge the platelets at 1, 120 times g for 15 minutes to form the pellet. After the centrifugation is over, discard the supernatant and resuspend the platelets in one milliliter of platelet buffer maintained at pH 7.5.Then use an automated hematology analyzer to measure the platelet concentration in 1/10th dilution. Finally, adjust the cell count with platelet buffer maintained at pH 7.5. To secure the adherent platelets, immerse the glass coverslip in 1.2 molar 50%volume by volume of hydrochloric acid ethanol mixture.After immersing, wash the coverslip twice with ultrapure water. Then use nitrogen to dry the coverslip. Next, use 100 microliters of 30 micrograms per milliliter of rat collagen type one to pre-coat the glass coverslip.After coating the glass coverslip, incubate the coverslips at room temperature for 30 minutes. Then expel the collagen solution and wash the coverslip with phosphate buffered saline thrice. Next, use 1%bovine serum albumin in HEPES buffer to block the collagen coated coverslips for 30 minutes at room temperature.After 30 minutes, wash the coverslips and then dry them to mount in the perfusion chamber. After mounting the coverslips, keep the platelets ready. To immobilize the platelets, transfer 70 microliters of platelet suspension to a channel and incubate for 1-1/2 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.Then replace the nonadherent platelets with blocking buffer for 30 minutes at room temperature. Use one micromolar of cell-permeant green fluorescence nucleic acid stain to fluorescently label the leukocytes. After labeling, incubate the leukocytes for 30 minutes at 37 degrees Celsius.Then centrifuge the cells at 300 times g for five minutes to pellet the cells. Resuspend in phosphate buffered saline to wash the cells. Then centrifuge the cells at 300 times g for five minutes.Based on the flow rate, suspend five milliliters of the cells in assay buffer. Then heat a water bath to maintain 37 degrees Celsius. Next, set aside a 50 milliliter perfusion syringe and install it on the syringe holder.Then set the pump on with draw mode with the pump volume at zero milliliter and diameter at 26.70 millimeter. Next, attach a Luer lock coupler to the syringe and connect the tubing with the elbow Luer connector to the Luer lock coupler. Then attach the free end of the tubing to the flow chamber.To adhere the leukocytes to the immobilized platelets, connect the microslide with the syringe. To perfuse the leukocytes and then adhere to a bed of vascular or platelet monolayer, attach a second tubing to a 50 milliliter conical tube containing the assay buffer and then fill the tubing using a one milliliter pipette. Once the tubing is filled, squeeze it and connect it to the flow chamber.Before perfusing the leukocytes, add three millimolar of calcium chloride and two millimolar of magnesium chloride to the cell suspension. Then incubate the cells at 37 degrees Celsius for five minutes. To remove possible air stuck in the chamber and in the tubing, perfuse with assay buffer before perfusing the cells.Next, squeeze the tubes to close the end and switch the tubing from the assay buffer to the cell suspension thereby preventing any trapped air bubbles within. For the first cells to arrive, perfuse the cells at appropriate flow rate and shear stress. Keep perfusing the cells, maintaining the flow rate and shear stress for two minutes.Then capture six images of the rolling and adherent cells between two to six minutes using a fluorescence microscope with 10X magnification connected to a digital camera. In this assay, adhesion of green fluorescently labeled THP1 cells with the endothelial cells was analyzed in the presence or absence of tumor necrosis vector alpha stimulation. The graph and the fluorescence images obtained show significant increase in THP1 cell arrest upon stimulating the endothelial cells with tumor necrosis vector alpha in comparison to the control.When recorded in time lapse, transendothelial migration of primary monocytes can be monitored over time. Next, adhesion of fluorescently labeled neutrophils with immobilized platelet monolayer in a flow chamber was analyzed in the presence or absence of TRAP-6 stimulation. The plot obtained shows a sharp increase in the adhesion of neutrophils to the TRAP-6 stimulated platelets in comparison to the control.Next, platelets were obtained from JAM-A deficient mice to study its adhesion with raw 264.7 mouse monocyte in the presence of surface receptor inhibitors. The graph and the fluorescence images obtained show significant decrease in the adhesion of the mouse monocytes with the platelets when compared to the control. Further, to study the adhesion of raw 264.7 cells with platelets, JAM-A positive and deficient mice were exposed to incremental increase of shear stress.From the graph, it's clear that the adhesion of raw 264.7 cells with platelets obtained from JAM-A deficient mice are more resistant to shear stress than JAM-A positive platelets. Once mastered, this technique can be done in one day if performed properly. While attempting this procedure, it is important to very gently wash your platelets during isolation so that your platelets do not become pre-activated or aggregated.It is also crucial to make sure that you don't have any air bubbles in your flow system because the system might get congested and to ensure a stable and even shear stress. Following this procedure, underlying mechanisms of leukocyte recruitment during vascular inflammation can be investigated.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

التصوير التصاق كريات بيضاء لبطانة الأوعية الدموية في الضغط داخل اللمعة السامية

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

والحشرات<em&gt; جاليريا mellonella</em&gt; نموذجا عدوى قوية المعنية بالتحقيق في إمراض البكتيرية

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

التفاعلات حيوي داخلي المجهري من خلايا الدم البيضاء-البطانية وصفائح الدم الكريات البيض في المساريقية الأوردة في الفئران

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

باستخدام تحليل النشوء والتطور للتحقيق التوكسينات الجينات الأصل

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...