Name: laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets at JoVE.com

Agradecemos a los Drs. Martín M. Schmitt y Fraemohs línea. Este trabajo fue financiado por la fundación holandesa para la investigación científica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fundación para la investigación de la transfusión de sangre (LSBR Nr. 1638) y Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) otorgado a R.R.K.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ética médica y Animal ético tableros de la Universidad de Maastricht.
1. flujo basada en el ensayo con células humanas
<ol><li>
Aislamiento de las plaquetas de sangre humana
	<ol>
<li>Extraer la sangre venosa en anticoagulante de citrato (3.2%).</li>
		<li>Añadir el 15/1 volumen de ácido citrato dextrosa (ACD: citrato trisódico 80 mM, 52 mM cítrico y 183 mM de glucosa) a la sangre.</li>
		<li>Centrifugue a ...

<ol>
	<li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function.">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis.">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li><li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury.">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li><li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice.">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li><li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb&#945;.">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIb&#945;.</a> Nature communications. 8, 15559 (2017).</li><li>Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS-based+microfluidic+devices+for+biomedical+applications.">PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications.</a> Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).</li><li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+shear+viscosity+and+shear+rate+from+pressure+drop+and+flow+rate+relationship+in+a+rectangular+channel.">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).</li><li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis.">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li></ol>

Este ensayo en vitro es un método sencillo para investigar mecanismos subyacentes del reclutamiento de leucocitos durante la inflamación vascular, pero hay algunos puntos críticos a ser observado. El primer requisito para la realización con éxito de este ensayo es la perfusión de leucocitos en un intacto y confluentes vasculares o monocapa de plaquetas. Esto puede lograrse por capa previa de las superficies con colágeno de tipo I. En general, cuando se trabaja con las células vasculares primarias, es imp...

Sobre la lesión, inflamación o infección, leucocitos responden rápidamente al patógeno o daños asociada - molecular (PAMPs, humedades), cambiar a un estado activado y salir del torrente sanguíneo a sitios de inflamación y tejido de daños. La capacidad de interactuar con su entorno celular y molecular de los leucocitos es esencial para su correcto funcionamiento como las células inmunes, como resaltado por trastornos genéticos como de deficiencia de adhesión leucocitaria1. Adherencia del leucocito ha sido objeto de intensa investigación durante las últimas décadas y esto ha derivado en el concepto de la cascada de adhesión leucocitaria en los comienzos del decenio de 19902,3. Adherencia del leucocito es iniciada por la captura de selectina-mediada de los leucocitos al endotelio, causando las células a rodar sobre la superficie vascular. Este balanceo permite leucocitos buscar señales migratorias endotelio-limite, por ejemplo, quimiocinas, que inducen la activación de las integrinas. Posteriormente, las integrinas activadas median la Unión a ligandos endoteliales, dando por resultado la detención firme del leucocito. Leucocitos pueden posteriormente preparar a extravasate de arrastre y difusión, antes de penetrar en la monocapa endotelial y transmigrating en el tejido subyacente. El concepto básico de la cascada del leucocito canónico ha permaneció prácticamente sin cambios desde su introducción, con algunos pasos intermedios adicionales4. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos y los roles de los jugadores muchos involucrados en el reclutamiento leucocitario no aclarados hasta el momento, y reclutamiento leucocitario sigue siendo un tema importante en el campo de la infección, la inflamación y (auto-) inmune investigación.
Por ejemplo, durante enfermedades inflamatorias vasculares como la aterosclerosis, mayor reclutamiento leucocitario en el desarrollo de placa buque pared unidades. Las placas ateroscleróticas inestables podrían romperse, llevando a la activación masiva de las plaquetas y el sistema de coagulación y posteriormente a la obstrucción de los vasos5. Esto puede resultar en resultados cardiovasculares graves como infarto de miocardio o accidente cerebrovascular. Además, denudación endotelial, como ocurre clínicamente, por ejemplo, después de stenting de la arteria coronaria, conduce a una multitud de interacciones de los leucocitos y las plaquetas en el interior de pared expuesta del recipiente (p. ej., componentes de la matriz y liso las células del músculo) y de leucocitos con las plaquetas cubriendo la lesión vascular. Estas interacciones son importantes para el desarrollo de la enfermedad como interacciones de monocito plaquetas podrían conducir la formación de neoíntima6,7. Además, las interacciones plaquetas leucocitos mediaron por la integrina leucocitaria Mac-1 (α βM2) y plaquetas GPIbα recientemente han sido identificadas como nuevos controladores de la trombosis en ratones8.
Dada la amplia disponibilidad de sangre humana y animal como fuente de leucocitos y plaquetas para la investigación y el amplio espectro de moléculas de matriz aislada y líneas celulares inmortalizadas de leucocito y de origen vascular, es factible simular del leucocito interacciones bajo flujo en un laboratorio de creación, utilizando cámaras de perfusión de flujo especialmente diseñada. Muchas variantes se han diseñado en las últimas décadas, que van de vacío a cámaras de perfusión auta-adhesivo. Todas las variantes tienen en común que la parte inmóvil (p. ej., células vasculares cultivadas o proteínas de la matriz) está montada en una cámara de prueba de fugas más grande equipada con un canal predefinido que permite la perfusión de fluidos sobre la parte inmóvil. Además, avances en la tecnología de moldeo permitieron el desarrollo de soluciones a medida basadas en polímeros de sílice9. La viscosidad y la velocidad de flujo de los líquidos perfundidos y la altura del canal principalmente determinan las características de la tensión de esquileo del flujo perfusión dispositivo10. En este artículo presentamos un método en vitro para estudiar los mecanismos subyacentes de la adherencia, la adherencia y transmigración de leucocitos bajo regímenes de flujo venoso y arterial. La ventaja de los métodos presentados aquí es que se puede realizar utilizando un microscopio de fluorescencia con cámara conectada común y no requieren un experimentadores poseer alto nivel técnico. El ensayo en vitro puede ser manipulado de muchas maneras (por ejemplo, mediante la adición de inhibidores o anticuerpos de bloqueo) y por lo tanto es aplicable en diferentes modelos de inflamación vascular y permite la investigación de la adherencia de funciones de la proteína o la evaluación de compuestos específicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:939px;" width="938">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies Europe bv</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Pump e.g. model: 210-CE</td>
			<td style="width:189px;">&#160;world precision instruments</td>
			<td style="width:163px;">78-9210W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:189px;">corning</td>
			<td style="width:163px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:189px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">300137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">228-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Elbow Luer Connector Male</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td style="width:163px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Female Luer Lock Coupler</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td style="width:163px;">10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:189px;">University Hospital RWTH Aachen</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&#246;mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&#228;ngen an Zelloberfl&#228;chen. 2005.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Ibidi sticky slide VI 0.4</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverslips for sticky slides&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Ibidi</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td>Life Technologies Europe bv</td>
			<td style="width:163px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)</td>
			<td>Anaspec / Eurogentec</td>
			<td>24191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain</td>
			<td>Life Technologies Europe bv</td>
			<td>S7575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Hanks&#8217; Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>H4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES buffer solution 1M, liquid</td>
			<td>Life Technologies Europe bv</td>
			<td>15630049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BUMINATE Albumin, 25%&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Water for injection</td>
			<td style="width:189px;">B. Braun</td>
			<td style="width:163px;">3624315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:189px;">Merck</td>
			<td style="width:163px;">102382&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td style="width:163px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:189px;">Promocell GmbH</td>
			<td>C-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td style="width:189px;">Promocell GmbH</td>
			<td>C-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">&#160;PCS-100-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Vascular Cell Basal Medium&#160;</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Endothelial Cell Growth Kit-BBE</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">PCS-100-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Human endothelial cell line, EA.hy926</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">CRL-2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Human Monocytic cell line, THP-1</td>
			<td style="width:189px;">DSMZ</td>
			<td style="width:163px;">ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with Ultra-Glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Lonza</td>
			<td>BE12-702F/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Mouse monocyte/macrophage RAW264.7</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:163px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td style="width:189px;">Gibco</td>
			<td style="width:163px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">Accutase</td>
			<td style="width:189px;">Promocell GmbH</td>
			<td>C-41310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">Percoll</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">Histopaque 1119</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td>11191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:420px;">10x PBS</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies Europe bv</td>
			<td style="width:163px;">14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:420px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin</td>
			<td style="width:189px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">367876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Greiner Bio</td>
			<td style="width:163px;">455322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:420px;">HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich Chemie</td>
			<td style="width:163px;">Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets

El reclutamiento de los leucocitos sobre lesiones o inflamación a los sitios de lesión o daño tisular ha sido investigado durante las últimas décadas y se ha traducido en el concepto de la cascada de adhesión leucocitaria. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos involucrados en el reclutamiento leucocitario todavía no sido plenamente identificados. Puesto que el reclutamiento del leucocito sigue siendo un tema importante en el campo de la infección, la inflamación y la (auto) inmune investigación, presentamos un ensayo sencillo basado en el flujo laminar para estudiar los mecanismos subyacentes de la adherencia, la adherencia, y transmigración de leucocitos bajo regímenes de flujo venoso y arterial. El ensayo en vitro puede utilizarse para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares en diferentes modelos de inflamación vascular. Este protocolo describe un ensayo de flujo laminar usando una cámara de flujo paralelo y un microscopio invertido de contraste de fase conectada a una cámara para estudiar las interacciones de los leucocitos y las células endoteliales o plaquetas, que pueden ser visualizadas y registradas entonces Análisis fuera de línea. Las células endoteliales, plaquetas y leucocitos pueden ser pretratados con inhibidores o anticuerpos para determinar el papel de moléculas específicas durante este proceso. Condiciones de esfuerzo cortante, tensión de esquileo es decir, arterial o venoso, pueden ser adaptadas fácilmente por la viscosidad y la velocidad de flujo de los líquidos perfundidos y la altura del canal.

Para estudiar la adhesión endotelial leucocitaria, fluorescencia etiquetadas células THP-1 fueron perfundidas en una monocapa endotelial TNFα - o no-estimulados por 2 min a 3 Dina/cm2. El número total de células monocytic adherentes se determinó después de 2 min de la perfusión por la captura de 6 campos independientes durante un período de 2-6 min. Las células adherentes se cuantificaron en al menos 6 imágenes capturadas con un microscopio de contraste de la fluores...

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Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

The overall goal of this experiment is to investigate the mechanisms behind the interactions of leukocytes to adherent vascular cells or platelets under flow conditions. This method can help answer key questions in the immunology field such as how leukocytes are recruited to sites of inflammation. The main advantage of this technique is that it's cost effective, user friendly, and allows the investigation of a great variety of experimental conditions.This method can provide insight into leukocyte adhesion. It can also be applied to other systems such as the adhesion of tumor cells to immobilized cells or substrates under flow conditions. Demonstrating the procedure will be Annemiek Dickhout, an engineer and a PhD student working in my laboratory.After obtaining blood samples, add 1/15th volume of acid citrate dextrose to the blood. Next, centrifuge the blood sample by setting the brakes off at 350 times g for 15 minutes to obtain platelet-rich plasma. Then transfer the supernatant obtained to a 15 milliliter conical tube and add 1/10th volume of acid citrate dextrose to it.Again, centrifuge the suspension by setting the brakes off at 1, 120 times g for 15 minutes to obtain platelet-poor plasma. Next, discard the supernatant. Next, carefully resuspend the platelet pellet in platelet buffer maintained at pH 6.6 using a Pasteur pipette with a wide bore.Then add 1/10th volume of acid citrate dextrose to it and gently mix it. Next, centrifuge the platelets at 1, 120 times g for 15 minutes to form the pellet. After the centrifugation is over, discard the supernatant and resuspend the platelets in one milliliter of platelet buffer maintained at pH 7.5.Then use an automated hematology analyzer to measure the platelet concentration in 1/10th dilution. Finally, adjust the cell count with platelet buffer maintained at pH 7.5. To secure the adherent platelets, immerse the glass coverslip in 1.2 molar 50%volume by volume of hydrochloric acid ethanol mixture.After immersing, wash the coverslip twice with ultrapure water. Then use nitrogen to dry the coverslip. Next, use 100 microliters of 30 micrograms per milliliter of rat collagen type one to pre-coat the glass coverslip.After coating the glass coverslip, incubate the coverslips at room temperature for 30 minutes. Then expel the collagen solution and wash the coverslip with phosphate buffered saline thrice. Next, use 1%bovine serum albumin in HEPES buffer to block the collagen coated coverslips for 30 minutes at room temperature.After 30 minutes, wash the coverslips and then dry them to mount in the perfusion chamber. After mounting the coverslips, keep the platelets ready. To immobilize the platelets, transfer 70 microliters of platelet suspension to a channel and incubate for 1-1/2 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.Then replace the nonadherent platelets with blocking buffer for 30 minutes at room temperature. Use one micromolar of cell-permeant green fluorescence nucleic acid stain to fluorescently label the leukocytes. After labeling, incubate the leukocytes for 30 minutes at 37 degrees Celsius.Then centrifuge the cells at 300 times g for five minutes to pellet the cells. Resuspend in phosphate buffered saline to wash the cells. Then centrifuge the cells at 300 times g for five minutes.Based on the flow rate, suspend five milliliters of the cells in assay buffer. Then heat a water bath to maintain 37 degrees Celsius. Next, set aside a 50 milliliter perfusion syringe and install it on the syringe holder.Then set the pump on with draw mode with the pump volume at zero milliliter and diameter at 26.70 millimeter. Next, attach a Luer lock coupler to the syringe and connect the tubing with the elbow Luer connector to the Luer lock coupler. Then attach the free end of the tubing to the flow chamber.To adhere the leukocytes to the immobilized platelets, connect the microslide with the syringe. To perfuse the leukocytes and then adhere to a bed of vascular or platelet monolayer, attach a second tubing to a 50 milliliter conical tube containing the assay buffer and then fill the tubing using a one milliliter pipette. Once the tubing is filled, squeeze it and connect it to the flow chamber.Before perfusing the leukocytes, add three millimolar of calcium chloride and two millimolar of magnesium chloride to the cell suspension. Then incubate the cells at 37 degrees Celsius for five minutes. To remove possible air stuck in the chamber and in the tubing, perfuse with assay buffer before perfusing the cells.Next, squeeze the tubes to close the end and switch the tubing from the assay buffer to the cell suspension thereby preventing any trapped air bubbles within. For the first cells to arrive, perfuse the cells at appropriate flow rate and shear stress. Keep perfusing the cells, maintaining the flow rate and shear stress for two minutes.Then capture six images of the rolling and adherent cells between two to six minutes using a fluorescence microscope with 10X magnification connected to a digital camera. In this assay, adhesion of green fluorescently labeled THP1 cells with the endothelial cells was analyzed in the presence or absence of tumor necrosis vector alpha stimulation. The graph and the fluorescence images obtained show significant increase in THP1 cell arrest upon stimulating the endothelial cells with tumor necrosis vector alpha in comparison to the control.When recorded in time lapse, transendothelial migration of primary monocytes can be monitored over time. Next, adhesion of fluorescently labeled neutrophils with immobilized platelet monolayer in a flow chamber was analyzed in the presence or absence of TRAP-6 stimulation. The plot obtained shows a sharp increase in the adhesion of neutrophils to the TRAP-6 stimulated platelets in comparison to the control.Next, platelets were obtained from JAM-A deficient mice to study its adhesion with raw 264.7 mouse monocyte in the presence of surface receptor inhibitors. The graph and the fluorescence images obtained show significant decrease in the adhesion of the mouse monocytes with the platelets when compared to the control. Further, to study the adhesion of raw 264.7 cells with platelets, JAM-A positive and deficient mice were exposed to incremental increase of shear stress.From the graph, it's clear that the adhesion of raw 264.7 cells with platelets obtained from JAM-A deficient mice are more resistant to shear stress than JAM-A positive platelets. Once mastered, this technique can be done in one day if performed properly. While attempting this procedure, it is important to very gently wash your platelets during isolation so that your platelets do not become pre-activated or aggregated.It is also crucial to make sure that you don't have any air bubbles in your flow system because the system might get congested and to ensure a stable and even shear stress. Following this procedure, underlying mechanisms of leukocyte recruitment during vascular inflammation can be investigated.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

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Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Investigación

Inmunología e Infección

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

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El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

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Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

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Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

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A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial

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