We ontdekten dat HLA-I epigenetisch naar beneden is gereguleerd in een subpopulatie van kankercellen die stamceleigenschappen en tumorinitierende capaciteit vertonen. HLA-I downregulation is direct gerelateerd aan immuun ontsnappen, het verstrekken van overlevingsvoordelen voor kanker stamcellen, waardoor HLA-I negativiteit een nauwkeurige functionele marker voor deze cellen. Het demonstreren van de procedure zal Sudeh Izadmehr zijn, een postdoc uit ons laboratorium.
Bij aankoop van het monster, plaats het weefsel in een 100-millimeter petrischaal in een gesteriliseerde bio-veiligheidskast, en voeg 500 microliters van steriele PBS aan de schotel. Gebruik een steriele scalpel om het weefsel mechanisch te tritureren in kleine stukjes totdat geen fragment groter is dan 0,1 millimeter. Breng het volledige 500-microliter volume PBS door middel van een 35-micrometer poriecelzeef over in een conische buis van 50 milliliter.
Voeg nog eens 500 microliter PBS toe aan de weefselfragmenten en maak de weefsels weer fijn. Vervolgens filter de supernatant door de celzeef in dezelfde opvangbuis, en blijf de weefselstukken gehakt totdat het monster volledig is gescheiden. Wanneer het laatste volume van de cellen is verzameld, spin de tumorcellen door centrifugatie, en opnieuw opschorten de pellet in vijf milliliter van hemolyse buffer.
Na vijf minuten bij kamertemperatuur, verzamel de cellen met een andere centrifugatie, en was de pellet met nog eens vijf milliliter PBS. Stel de pellet opnieuw op in een milliliter PBS en tel de levensvatbare cellen. Verdun de cellen tot een een keer 10 tot de zevende cellen per 200 microliter van PBS concentratie op ijs, en voeg 200 microliter van kelder membraan matrix aan de cellen met zachte mengen.
Injecteer vervolgens de celopening-keldermembraanmatrix onderhuids in de flank van een NOD scid gammamuis en controleer twee keer per week de groei van de tumor op de injectieplaats. Wanneer de tumor bereikt een centimeter in diameter, snijd de tumor in de helft, en fix de helft van de xenograft met 4%paraformaldehyde 's nachts voor histologische analyse. Verwerk de tweede helft van de tumor zoals net aangetoond om een eencellige suspensie te bereiken, en verdun de cellen tot een twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter PBS aangevuld met 5%FBS concentratie.
Houd de cellen 30 minuten op ijs voordat u de celsuspensie verdeelt tussen één isotypecontrole en één antilichaambuis. Let op het aantal cellen in elke buis en meng de cellen in de antilichaambuis met anti-HLA-antilichaam en de cellen in de isotypecontrolebuis met een geschikt anti-isotype controleantilichaam voor een incubatie van 90 minuten op ijs. Verzamel aan het einde van de incubatie beide celpopulaties door centrifugatie, gevolgd door twee PBS-wasbeurten van 10 milliliter PBS door centrifugatie.
Na de tweede wasbeurt, opnieuw opschorten de pellets in 10 microgram per milliliter van DAPI tot een een keer 10 tot de zeven cellen per milliliter concentratie. Vervolgens filteren elke cel suspensie door middel van een 35-micrometer porie zeef in individuele 12-bij-75-millimeter polystyreen buizen. Verdun na fluorescentie-geactiveerde celsorde de HLA-I-negatieve en positieve celpopulaties tot individu één keer 10 tot de vijfde celconcentraties in 15 milliliter van het sarcosfeergroeimedium per subset.
Verdun de cellen in serie tot één keer 10 tot de vierde, 10 tot de derde en 10 tot de tweede concentraties in 15 milliliter vers sarcosfeergroeimedium per verdunning, en voeg 100 microliter cellen van cellen toe van elke verdunning aan elke put van één 96-goed ultralaage bevestigingscelcultuurplaat per verdunning. Plaats de platen in een 37-graden Celsius, 5%koolstofdioxide cel cultuur incubator, het toezicht op de sarcosfeer vorming dagelijks door licht microscopie en het toevoegen van verse fundamentele fibroblast groeifactor en epidermale groei factor om elke goed zonder het medium te veranderen om de drie dagen. Tel na drie weken het aantal sarcosfeerpositieve en sarcosfeernegatieve putten voor elke celverdunning van zowel HLA-I-negatieve als HLA-I-positieve cellen om de berekening van de bolvormende celfrequentie op basis van een Poisson-waarschijnlijkheidsverdeling mogelijk te maken.
Typisch, menselijke patiënt-afgeleide sarcoom xenografts bestaan uit twee verschillende HLA-I-positieve en negatieve populaties, met een vergelijkbare histologie aan die aangetoond door de ouderlijke primaire tumor. Fluorescentie-geactiveerde celsorde van sarcoom-afgeleide xenograft tumor-initiërende cellen zoals aangetoond vergemakkelijkt de verrijking van een groot aantal HLA-I-negatieve cellen uit de ouderlijke celpopulatie. HLA-I-negatieve cellen zijn in staat om bollen te vormen met een initiële input van zo weinig als 10 cellen en vertonen een hogere tumorvorming vermogen dan HLA-I-positieve sarcoom patiënt aangekomen xenograft tumor-initiërende cellen.
Injectie van hetzelfde aantal HLA-I negatieve en positieve cellen onderhuids in tegengestelde flanken van dezelfde muis toont aan dat HLA-I-negatieve cellen een aanzienlijk hogere tumorvorming vermogen bezitten. Terwijl xenografts gevormd door zowel HLA-I negatieve en positieve sub-populaties zijn cellulair heterogene tumoren. Verder, genexpressie analyse van de tumor-initiërende cellen blijkt dat HLA-I-negatieve cellen stamcel differentiatie markers uitdrukken en kan worden geïnduceerd om te differentiëren langs zowel lipogene en osteogene paden, waaruit blijkt sterke Olie-Red-O en Alizarin-Red-S vlekken en cultuur.
Deze methode kan worden gebruikt om kankercellen te isoleren in verschillende menselijke kankers. Moleculaire carbonisatie, bijvoorbeeld, door de volgende generatie sequencing kan onthullen gemeenschappelijke markers voor het richten van de cellen therapeutisch. Onze ontdekking toont aan dat het herstel van HLA-I is een cruciale stap voor het succes van functionele eenheid immuuncelvergroting strategieën.
