우리는 HLA-I가 줄기 세포 속성 및 종양 시작 용량을 전시하는 암세포의 하위 인구에서 후성 유전학적으로 통제된다는 것을 것을을 발견했습니다. HLA-I 다운규제는 면역 탈출과 직접적인 관련이 있으며, 암 줄기 세포에 대한 생존 이점을 제공하므로 HLA-I 부정성을 이러한 세포에 대한 정확한 기능적 마커로 만듭니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 포스트 닥, Sudeh Izadmehr 될 것입니다.
시료를 획득하면 조직을 멸균 된 생체 안전 캐비닛에 100mm 페트리 접시에 넣고 500 마이크로리터의 멸균 PBS를 접시에 넣습니다. 멸균 메스를 사용하여 조각이 0.1 밀리미터보다 크지 때까지 조직을 작은 조각으로 기계적으로 세살합니다. 35마이크로미터 모공 세포 스트레이너를 통해 PBS의 전체 500마이크로리터 부피를 50밀리리터 원유형 튜브로 옮킨다.
조직 단편에 PBS의 또 다른 500 마이크로 리터를 추가하고 조직을 다시 다진다. 그런 다음 셀 스트레이너를 통해 상체를 동일한 수집 튜브로 필터링하고 샘플이 완전히 해리 될 때까지 조직 조각을 계속 다진다. 세포의 마지막 부피가 수집되면, 원심분리에 의해 종양 세포를 스핀다운하고, 용혈 완충제의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.
실온에서 5 분 후, 다른 원심 분리와 세포를 수집하고 PBS의 또 다른 5 밀리리터와 펠릿을 세척. PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 실행 가능한 세포를 계산합니다. 얼음에 PBS 농도의 200 마이크로 리터 당 일곱 번째 세포에 10 에 10에 세포를 희석하고 부드러운 혼합으로 세포에 지하 막 매트릭스의 200 마이크로 리터를 추가합니다.
그런 다음 NOD scid 감마 마우스의 측면에 셀 서스펜션-지하 막 매트릭스를 피하로 주입하고 주 2회 주사 부위에서 종양의 성장을 확인한다. 종양이 직경 1센티미터에 도달하면 종양을 반으로 자르고 조직학적 분석을 위해 하룻밤 사이에 4 %의 파라포름알데히드로 xenograft의 절반을 수정합니다. 종양의 후반을 공정한 바와 같이 단하나 세포 현탁액을 달성하고, 5%의 FBS 농도로 보충된 PBS의 밀리리터 당 6개의 세포로 세포를 2회 10으로 희석시켰다.
1개의 등류형 대조군과 1개의 항체 관 사이 세포 현탁액을 분할하기 전에 30 분 동안 얼음에 세포를 유지합니다. 각 튜브내의 세포의 수를 주목하고, 항체 관내세포를 항체 및 동종형 대조관 관내세포와 혼합하여 얼음에 대한 90분 배양에 적합한 항등형 대조군 항체를 갖는다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 두 세포 집단을 수집하고, 두 개의 10 밀리리터 PBS는 원심 분리에 의해 세서징.
두 번째 세척 후, 탄환을 다시 중단 10 밀리리터 당 마이크로 그램 DAPI의 밀리 리터 당 마이크로 그램 10 밀리 리터 농도 당 7 세포에 10. 그런 다음 35 마이크로미터 모공 여과기를 통해 각 세포 현탁액을 개별 12 x 75 mm 폴리스티렌 튜브로 필터링합니다. 형광 활성화 세포 분류 후, HLA-I-음성 및 양성 세포 집단을 10번으로 희석하여 서브세트당 육사권 성장 배지의 15 밀리리터에서 제5 세포 농도로 1회 씩 희석한다.
세포를 10대 4, 10대 3, 희석당 15밀리리터에서 10개 농도로 연속적으로 희석하고, 희석당 96-매우 낮은 부착세포 배양플레이트 1개 각각에 각 희석으로부터 100마이크로리터의 셀을 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터5%에 넣고, 광 현미경으로 매일 육각구 형성을 모니터링하고, 3일마다 배지를 변경하지 않고 신선한 기본 섬유아세포 성장 인자 및 표피 성장 인자를 각 웰에 첨가한다. 3주 후, HLA-I-음성 및 HLA-I 양성 세포의 각 세포 희석에 대해 육구 양성 및 육사권-음수 웰의 수를 계산하여 푸아송 확률 분포를 기반으로 구형성 세포 주파수의 계산을 허용한다.
전형적으로, 인간 환자 유래 육종 이식은 부모 1 차종양에 의해 입증된 것과 유사한 히스토로지와 함께 두 개의 별개의 HLA-I 양성 및 부정적인 집단으로 구성됩니다. 유언증이 입증된 바와 같이 육종 환자 유래 xenograft 종양 개시 세포의 형광 활성화 세포 분류는 부모 세포 집단으로부터 많은 수의 HLA-I-음성 세포의 농축을 용이하게 한다. HLA-I-음성 세포는 10개의 세포의 초기 입력으로 구체를 형성하고 HLA-I 양성 육종 환자보다 더 높은 종양 형성 능력을 나타낼 수 있다.
HLA-I 음성 및 양성 세포의 동일한 수의 주사는 HLA-I-음성 세포가 상당히 높은 종양 형성 능력을 가지고 있음을 보여줍니다. HLA-I 음성 및 양성 하위 인구 모두에 의해 형성된 이종이 이식은 세포적으로 이질적인 종양입니다. 또한, 종양 개시 세포의 유전자 발현 분석은 HLA-I-음성 세포가 줄기 세포 분화 마커를 발현하고 리포겐성 및 골성 경로를 따라 분화하도록 유도될 수 있음을 밝혀, 강한 오일-레드-O 및 알리자린-레드-S 염색 및 배양.
이 방법은 다양한 인간 암에서 암 줄기 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 분자 탄화, 예를 들어, 차세대 시퀀싱에 의하면 세포를 치료적으로 표적화하기 위한 일반적인 마커를 드러낼 수 있다. 우리의 발견은 HLA-I의 복원이 기능성 단위 면역 세포 확대 전략의 성공을 위한 중요한 단계이다는 것을 보여줍니다.
