Vi oppdaget at HLA-I er epigenetically ned regulert i en underbefolkning av kreftceller som viser stamcelleegenskaper og tumorinitierende kapasitet. HLA-I nedregulering er direkte relatert til immunflukt, noe som gir overlevelsesfordeler for kreftstamceller, noe som gjør HLA-I negativitet til en nøyaktig funksjonell markør for disse cellene. Å demonstrere prosedyren vil være Sudeh Izadmehr, en postdoktor fra laboratoriet vårt.
Ved oppkjøpet av prøven, legg vevet i en 100-millimeter petriskål i et sterilisert bio sikkerhetsskap, og legg til 500 mikroliter steril PBS til parabolen. Bruk en steril skalpell til å mekanisk triturere vevet i små biter til ingen fragment er større enn 0,1 millimeter. Overfør hele 500 mikrolitervolumet av PBS gjennom en 35-mikrometer porecellesil til et konisk rør på 50 milliliter.
Tilsett ytterligere 500 mikroliter PBS til vevsfragmentene, og hakke vevet igjen. Deretter filtrerer du supernatanten gjennom cellesilen inn i samme oppsamlingsrør, og fortsetter å hakke vevsbitene til prøven er helt dissosiert. Når det siste volumet av celler er samlet, spinne ned tumorcellene ved sentrifugering, og re-suspendere pellet i fem milliliter hemolyse buffer.
Etter fem minutter ved romtemperatur, samle cellene med en annen sentrifugering, og vask pellet med ytterligere fem milliliter PBS. Re-suspendere pellet i ett milliliter PBS, og telle levedyktige celler. Fortynn cellene til en gang 10 til de syvende cellene per 200 mikroliter PBS konsentrasjon på is, og tilsett 200 mikroliter kjellermembranmatrise til cellene med mild blanding.
Deretter injiserer cellesuspensjon-kjellermembranmatrise subkutant inn i flanken av en NOD-scid gammamus, og kontroller veksten av svulsten på injeksjonsstedet to ganger i uken. Når svulsten når en centimeter i diameter, kutt svulsten i to, og fest halvparten av xenograft med 4% paraformaldehyd over natten for histologisk analyse. Behandle andre halvdel av svulsten som nettopp demonstrert for å oppnå en enkelt celle suspensjon, og fortynne cellene til en to ganger 10 til de seks cellene per milliliter PBS supplert med 5% FBS konsentrasjon.
Hold cellene på is i 30 minutter før du deler cellefjæringen mellom en isotypekontroll og ett antistoffrør. Legg merke til antall celler i hvert rør, og bland cellene i antistoffrøret med anti-HLA antistoff og cellene i isotypekontrollrøret med et passende anti-isotypekontrollantistoff for en 90-minutters inkubasjon på is. På slutten av inkubasjonen samler du begge cellepopulasjonene ved sentrifugering, etterfulgt av to 10-milliliter PBS vasker ved sentrifugering.
Etter den andre vasken, re-suspendere pellets i 10 mikrogram per milliliter DAPI til en gang 10 til de syv cellene per milliliter konsentrasjon. Deretter filtrerer du hver celle suspensjon gjennom en 35-mikrometer pore sil i individuelle 12-by-75-millimeter polystyren rør. Etter fluorescens-aktivert cellesortering, fortynne HLA-I-negative og positive cellepopulasjoner til individuelle en ganger 10 til femte cellekonsentrasjoner i 15 milliliter av sarkastosfæren vekst medium per undergruppe.
Serially fortynne cellene til en ganger 10 til fjerde, 10 til den tredje, og 10 til den andre konsentrasjonen i 15 milliliter av fersk sarkastosfære vekst medium per fortynning, og legge til 100 mikroliter celler fra hver fortynning til hver brønn av en 96-godt ultra-lav vedlegg celle kultur plate per fortynning. Plasser platene i en 37-graders Celsius, 5% karbondioksidcellekulturinkubator, overvåke sarkastosfæreformasjonen daglig ved lett mikroskopi og legge til frisk grunnleggende fibroblastvekstfaktor og epidermal vekstfaktor til hver brønn uten å endre mediet hver tredje dag. Etter tre uker teller du antall sarkosfærepositive og sarkastosfærenegative brønner for hver cellefortynning av både HLA-I-negative og HLA-I-positive celler for å tillate beregning av sfæredannende cellefrekvens basert på en Poisson-sannsynlighetsfordeling.
Vanligvis består menneskelige pasientavledede sarkom xenografter av to forskjellige HLA-I-positive og negative populasjoner, med en lignende histologi som demonstrert av foreldrenes primære svulst. Fluorescens-aktivert celle sortering av sarkom pasient-avledet xenograft tumorinitiere celler som demonstrert letter berikelsen av et høyt antall HLA-I-negative celler fra foreldrecellepopulasjonen. HLA-I-negative celler er i stand til å danne kuler med en innledende inngang på så lite som 10 celler og viser en høyere tumordannelse evne enn HLA-I-positiv sarkom pasient kom xenograft tumorinitiere celler.
Injeksjon av samme antall HLA-I negative og positive celler subkutant i motstridende flanker av samme mus viser at HLA-I-negative celler har en betydelig høyere tumordannelse evne. Mens xenografts dannet av både HLA-I negative og positive underpopulasjoner er cellulært heterogene svulster. Videre viser genuttrykksanalyse av tumorinitierende celler at HLA-I-negative celler uttrykker stamcelledifferensieringsmarkører og kan induseres til å differensiere langs både lipogene og osteogene veier, noe som viser sterke olje-rød-o og Alizarin-Red-S farging og kultur.
Denne metoden kan brukes til å isolere kreft stamceller i ulike menneskelige kreftformer. Molekylær karbonisering, for eksempel ved neste generasjons sekvensering, kan avsløre vanlige markører for å målrette cellene terapeutisk. Vår oppdagelse viser at restaureringen av HLA-I er et kritisk skritt for suksessen til funksjonelle enhet immuncelleforstørrelsesstrategier.
