Name: an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers at JoVE.com

De auteurs wil erkennen Sphingonet consortium gefinancierd door de Leduq foundation ter ondersteuning van dit werk. Dit werk werd ook ondersteund door het Collaborative Research Center "vasculaire differentiatie en remodeling" (CRC / Transregio23, Project C1) en door de 7. FP, COFUND, Goethe internationale Postdoc programma GO-IN, No. 291776 financiering. Wij erkennen verder Kathleen Sommer voor haar technische bijstand met muizen, behandeling en genotypering.

Alle dieren die werden behandeld met de grootste zorg minimaliseren van pijn of ongemak tijdens de procedure. Deze procedure volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van onze instelling en is goedgekeurd door het plaatselijke comité (Regierungspraesidium Darmstadt, erkenningsnummer FK/1044).
Een schematische voorstelling van de werk-stappen voor in vivo permeabiliteit assay in muizen is afgebeeld in Figuur 1. De details voor elke stap worden hieronder besc...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., R&#246;nnb&#228;ck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Dysfunction+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT-1+glucose+transporters+in+the+blood-brain+barrier:+differential+phosphorylation.">GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation.</a> Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).</li><li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+blood-brain+barrier+to+blood-brain+interface:+new+opportunities+for+CNS+drug+delivery.">From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease+and+other+disorders.">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+efflux+of+amyloid-&#946;+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis.">Increased efflux of amyloid-&#946; peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li><li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer's+disease.">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li><li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li><li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling.">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li><li>Scholz, A., Harter, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+angiopoietin-2+is+a+therapeutic+target+in+treatment-naive+and+bevacizumab-resistant+glioblastoma.">Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).</li><li>Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoside+diphosphate+kinase+B+regulates+angiogenic+responses+in+the+endothelium+via+caveolae+formation+and+c-Src-mediated+caveolin-1+phosphorylation.">Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).</li><li>Ziegler, N., Awwad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Catenin+Is+Required+for+Endothelial+Cyp1b1+Regulation+Influencing+Metabolic+Barrier+Function.">&#946;-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).</li><li>Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+sphingolipid+metabolism+as+a+putative+mechanism+underlying+LPS-induced+BBB+disruption.">Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+Low+Molecular+Weight+Fluorescein+Isothiocyanate+(FITC)-Dextrans+to+Assess+Blood-Brain+Barrier+Disruption:+Technical+Considerations.">High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations.</a> Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).</li><li>Armulik, A., Genov&#233;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li><li>Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging.">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li><li>Banks, W. A., Gray, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption:+roles+of+cyclooxygenase,+oxidative+stress,+neuroinflammation,+and+elements+of+the+neurovascular+unit.">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).</li><li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+claudins.">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li><li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+Role+of+Brain+Endothelial+Surface+Charge+and+Glycocalyx.">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li><li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+effects+of+the+blood-brain+barrier+on+the+transport+of+charged+molecules.">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li><li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells.">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li><li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose.">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li><li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier.">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li></ol>

Bloed - hersenbarrière dysfunctie wordt geassocieerd met een aantal neurologische aandoeningen, met inbegrip van de primaire en secundaire hersentumor of beroerte. BBB-verdeling wordt vaak geassocieerd met levensbedreigende CNS oedeem. Het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die leiden de opening tot of sluiting van de BBB wordt daarom van therapeutische belang in neurologische aandoeningen en vaak onderzocht door onderzoekers. Methoden te onderzoeken BBB permeabiliteit in vivo gemeld in de literatuur, zi...

De bloed - hersenbarrière (BBB) bestaat uit de microvasculaire endotheliale cellen (ECs) ondersteund door nauw pericytes (PCs), die ensheathed in de basale lamina, en astrocyten (ACs), die het membraan van de kelder met hun einde-voeten1 omhullen ,2. ECs interactie met verschillende celtypes die ondersteuning en regelen de barrièrefunctie, vooral ACs en PC's, en ook neuronen en microglia, die allemaal samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). De NVU is van cruciaal belang voor het functioneren van de BBB, waardoor het vervoer van bloed van toxinen en ziekteverwekkers uit het invoeren van de hersenen wordt beperkt. Deze functie is een gevolg van strakke-junctie moleculen zoals claudin-5, occludin, zonula occludens-1, die aanwezig zijn tussen de ECs en ook als gevolg van het optreden van vervoerders zoals p-Glycoproteïne (P-gp) dat efflux moleculen die worden ingevoerd door het endotheel terug in het vaartuig lumen1,2,3. De BBB zorgt echter voor het vervoer van essentiële moleculen zoals voedingsstoffen (ijzer, glucose, aminozuren) door specifieke vervoerders uitgedrukt op de EG plasma membranen1,2,3. De EG-laag is zeer gepolariseerd met betrekking tot de verdeling van de verschillende vervoerders tussen de luminal (bloed-gerichte) en abluminal (hersenen gerichte membranen) te voorzien in de specifieke en vectoriële vervoer functie4,5 . Terwijl de BBB beschermend met betrekking tot strak regulering van de CNS-omgeving is, is het een grote uitdaging voor CNS drug levering in ziekten zoals Parkinson met een functionele BBB. Zelfs in neurologische ziekten met BBB dysfunctie, kan niet er worden aangenomen dat de hersenen drug levering wordt verhoogd naarmate de barrière disfunctie kan ook schade aan de doelen van de specifieke vervoerder bijvoorbeeld zoals de ziekte van Alzheimer (AD). In AD, verschillende bèta amyloid vervoerders zoals LRP1, woede, P-gp bekend is dat ze dysregulated en daarom richten deze vervoerders zou zinloos6,7,8. De BBB is geschaad in verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, AD, meningitis, MS, en in de hersenen tumoren9,10,11. Herstel van de barrièrefunctie is een cruciaal onderdeel van de therapeutische strategie, en dus haar beoordeling is van cruciaal belang.
In dit werk, hebben wij beschreven een objectieve en kwantitatieve protocol voor permeabiliteit assay in knaagdieren dat we met succes op verschillende muis lijnen beide transgene en experimentele ziekte modellen10,12,13 toegepast ,14. De methode is gebaseerd op een eenvoudige intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie van de muizen te verwijderen van de traceurs van de vasculaire compartiment. Hersenen en andere organen zijn verzamelde post perfusie en permeabiliteit beoordeeld door een doelstelling en absolute permeabiliteit index op basis van metingen van de fluorescentie van weefsel homogenates in een afleesapparaat. Alle ruwe fluorescentie waarden worden gecorrigeerd voor de achtergrond met behulp van weefsel homogenates of serum van sham dieren die niet elke tracer ontvangt. Ruime belangrijk zijn opgenomen voor serum volume, serum fluorescentie, en het gewicht van de weefsels, dus opbrengst permeabiliteit-index die is absoluut en vergelijkbare tussen experimenten en weefseltypes (HLA). Voor het gemak van vergelijking tussen groepen, kunnen de absolute permeabiliteit indexwaarden worden gemakkelijk omgezet naar ratio's zoals we eerder12had uitgevoerd. Gelijktijdig, kunnen opgeslagen hemi-hersenen en nieren worden gebruikt voor tracer visualisatie door fluorescentie microscopie10. De klassieke fluorescentie microscopie heel waardevol in het verkrijgen van regionale verschil in permeabiliteit zij omslachtig als gevolg van subjectieve selectie van weefselsecties en afbeeldingen voor een semi-kwantitatieve analyse kan zijn. De gedetailleerde stappen worden gepresenteerd in het protocol en notities worden toegevoegd waar nodig. Dit biedt de nodige informatie voor het succesvol uitvoeren van de permeabiliteit in vivo bepaling in muizen die kunnen worden geschaald naar andere kleine dieren. De bepaling kan worden toegepast op vele soorten traceurs waardoor de lading en de grootte op basis van permeabiliteit beoordeling door een combinatie van verklikstoffen met verschillende fluorescentie spectra.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>D3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>D3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketavet)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline</td>
			<td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldhehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td>prepare a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rat alexa 568</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rat alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua polymount</td>
			<td>Polyscience Inc</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge butterfly needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>387455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1500.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes tissue wipers</td>
			<td>Kimberley-Clark Professional</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well black plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides superfrost plus</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE pestle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electric overhead stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR VOS 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Microm GmbH</td>
			<td>HM 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic perfusion system</td>
			<td>BVK Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers

Bloed - hersenbarrière (BBB) is een gespecialiseerde barrière die de hersenen communicatie beschermt tegen toxinen en ziekteverwekkers in het verkeer en onderhoudt de homeostase van de hersenen. De belangrijkste sites van de barrière zijn endotheliale cellen van de haarvaten van de hersenen waarvan barrièrefunctie het gevolg is van strakke intercellulaire kruispunten en efflux vervoerders uitgedrukt op het plasma-membraan. Deze functie wordt geregeld door de pericytes en de astrocyten die samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). Verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, de ziekte van Alzheimer (AD), hersentumoren worden geassocieerd met een verminderde functie van de BBB. Beoordeling van de BBB-permeabiliteit is daarom cruciaal bij de beoordeling van de ernst van de neurologische ziekte en het succes van de behandelingsstrategieën werkzaam.
Wij presenteren hier een eenvoudige, maar robuuste permeabiliteit assay die met succes zijn toegepast op verschillende muis zowel, genetische en experimentele modellen. De methode is zeer kwantitatieve en objectieve in vergelijking met de analyse van de fluorescentie tracer door microscopie dat algemeen wordt toegepast. Bij deze methode worden muizen intraperitoneally ingespoten met een mengeling van waterige inerte fluorescerende traceurs gevolgd door anesthetizing van de muizen. Cardiale perfusie van de dieren wordt uitgevoerd vóór de oogst van de hersenen, nieren of andere organen. Organen worden gehomogeniseerd en gecentrifugeerd gevolgd door fluorescentie-meting van de bovendrijvende substantie. Bloed getrokken uit de cardiale punctie net voordat perfusie voor normalisatie doel tot de vasculaire compartiment serveert. De fluorescentie van weefsel is genormaliseerd naar de natte gewicht en serum fluorescentie te verkrijgen een kwantitatieve tracer permeabiliteit index. Voor extra bevestiging, kan de contralaterale hemi-hersenen bewaard voor immunohistochemistry voor tracer fluorescentie visualisatie doeleinden worden gebruikt.

We hebben onlangs aangetoond dat angiopoietin-2 (Ang-2) winst-van-functie (GOF) muizen hogere vasculaire permeabiliteit van de hersenen dan controle muizen in gezonde omstandigheden10 hebben. In lijn-geïnduceerde muizen was het ook laat zien dat de muizen GOF had grotere maten van het infarct en grotere doorlaatbaarheid dan de controle nestgenoten. Deze resultaten tonen een kritische rol van Ang-2 in permeabiliteit bij de BBB. Het protocol is daarom gebruikt de GO...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers at JoVE.com

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

The overall goal of this procedure is to assess the permeability of brain vasculature in mice using fluorescently-labeled tracers to assess blood-brain barrier dysfunction in animal models. This method can help answer key questions in the blood-brain barrier field pertaining to neuro-vascular permeability in diseases and its recovery upon therapy. The main advantage of this method is that it is simple and quantitative.It gives the possibility for concurrent assessment of permeability by fluorometry, which is quantitative, and also fluorescence microscopy for regional defenses. The implications of this technique extend towards diagnosis and therapy of several neurological disorders, including brain tumors, stroke, and Alzheimer's disease because these diseases are associated with life-threatening brain edema and improvement of BBD function as a key therapeutic target. Demonstrating part of the procedure will be Miss Jadranka Macas, a scientific technology officer at the institute.Intraperitoneally inject mice with 100 microliters of two-millimolar tracer solution. Choose lysine-fixable tracers, such as dextrans labeled with FITC and TMR with distinct excitation emission spectra for minimal interference between the dyes. If combining tracers, inject 200 microliters of combined tracer solution intraperitoneally.Include vehicle-only injections to serve as sham controls for autofluorescence background subtraction. After each injection, allow five minutes before deeply anesthetizing the mice according to the approved institutional protocols. Prepare the animals for cardiac perfusion 10 minutes after anesthetic administration.Check the absence of paw twitch response to ensure that the mouse has reached a surgical plane of anesthesia. Lay the mouse to be perfused on its back and apply 80%ethanol on the skin of the abdominal area. After using small scissors to create a two-centimeter incision in the abdominal wall, separate the liver from the diaphragm, and then slowly cut through the diaphragm, exposing the plural cavity.Cut the ribcage bilaterally and fix the cut sternum to expose the left ventricle. Insert a 21-gauge butterfly needle connected to a peristaltic perfusion system in the posterior of the left ventricle. Puncture the right atrium and then use a one-milliliter pipette tip with the end cut off to quickly collect the 200 to 300 microliters of released blood and transfer to a serum collection tube.Store the collected blood on ice. As soon as the blood is collected, switch on the perfusion system and perfuse the animal for three minutes with room temperature calcium and magnesium ion-free PBS. Assess perfusion quality by noting the color of the liver and kidneys, which appear pale after perfusion.After harvesting the brain, verify that there is no blood visible in vessels of the meninges. The sample should be excluded from the permeability analysis if the perfusion quality is poor. Use a scalpel to separate the brain into two hemi-brains.Then dissect the cerebellum and olfactory lobe from one hemi-brain, and transfer the hemi-cerebrum to a two-milliliter tube. Place one harvested kidney to another two-milliliter tube. Immediately place the samples on dry ice.Natively embed the remaining kidney and hemi-brain with cerebellum and olfactory lobes intact in TissueTech optimal cutting temperature compound, and put it on dry ice. Lastly, after centrifuging the blood samples at 10, 000 G for 10 minutes at four degrees Celsius, transfer the serum supernatants to 1.5-milliliter tubes and place them in the dry ice container. Transfer the samples to the minus 80 degrees Celsius freezer as homogenization efficiency increases after freeze-thawing.Place the hemi-cerebrum and kidney samples on ice to thaw, and then weigh the tubes containing the organs. From these weights, subtract the mean value of approximately 20 empty tubes to get the tissue weight. Add 300 microliters of cold PBS to the tube containing kidney and 200 microliters to the tubes containing hemi-cerebrum.Homogenize each sample in the original microfuge tube with a PTFE pestle attached to an electric overhead stirrer, using about 15 strokes. Store the homogenized samples on ice, protected from light. Rinse the pestle with PBS in between samples and wipe dry before proceeding to the next sample.When all samples have been homogenized, centrifuge for 20 minutes at 15, 000 G and four degrees Celsius. Following centrifugation, transfer the supernatants to new 1.5-milliliter tubes on ice before proceeding to fluorescence measurement and quantification. Transfer the supernatant to a 384-well plate and insert the plate into fluorescence reader.Make sure the right excitation and emission wavelengths are included for the tracer and set the gain to Optimal. Start the measurement, and export the data as a spreadsheet to perform the calculations as described in the protocol. On the day of staining, thaw 10-micron cryostat sections mounted on slides at 37 degrees Celsius for 10 minutes.Then, fix the sections with 4%paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature, followed by quick-washing in PBS. Permeabilize and block non-specific binding in the sections by incubating in sterile PBS containing 1%PSA and 0.5%Triton X-100 for one hour at room temperature. After blocking, incubate the slides with a one-to-100 dilution of CD31 primary antibody for 1.5 hours at room temperature.After washing with PBS three times for five minutes each, perform secondary antibody incubation for one hour at room temperature with species-specific fluorescently labeled antibodies. Mount the stained sections with Aqua-Poly/Mount and leave overnight for polymerization at room temperature in the dark. Finally, acquire images using a spectral imaging confocal laser scanning microscope system.In order to establish the tracer circulation time for the permeability assay, a long circulation time of two hours is compared to a short circulation time of 15 minutes post tracer injection. The longer circulation time of two hours leads to low amounts of tracers accumulation in kidney compared to a short 15-minute circulation time potentially due to a high clearance FITC dextran shown in green from the vascular compartment. This effect is even more dramatic in the brain due to the tight blood-brain barrier.CD31 staining seen in the red channel confirmed the presence of vessels in the kidney at both time points examined and in the brain. Once mastered, this technique can be performed within five to six hours for 10 mice with two scientists working in tandem. While attempting this technique, it is important to remember to use tracers of right molecular weight, chart and fluorescence characteristics in order to answer the questions regarding the blood-brain barrier permeability.Following this procedure, other methods like immuno-histochemistry for BBD and disease fill on factors can be performed to answer additional questions, like severity and localization of disease site.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

Een bepaling voor de permeabiliteit van de zebravis embryonale neuroepitheel

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Beoordeling van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit door intraveneuze infusie van FITC-geëtiketteerden albumine in een muismodel van neurodegeneratieve ziekte

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Een benchtop benadering van de locatie specifieke bloed hersenbarrière opening met behulp van gerichte echografie in een rat model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrocorticografische opname van hersenschorsgebieden gemanipuleerd met behulp van een Adeno-geassocieerd virus gericht op cofilin bij muizen

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Transendotheliale weerstandsmeting om de integriteit van de celbarrière te beoordelen

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Auteur in de schijnwerpers: Toepassingen van TEER-detectie om de integriteit van de celbarrière te beoordelen 

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...