Name: an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00
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Die Autoren möchten Sphingonet Konsortium finanziert von der Leduq-Stiftung für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen. Diese Arbeit wurde auch von den Sonderforschungsbereich "vaskuläre Differenzierung und Umbau" unterstützt (CRC / Transregio23, Projekt C1) und durch die 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc-Programm GO-IN, Nr. 291776 Finanzierung. Wir erkennen weiter Kathleen Sommer für ihre technische Unterstützung mit Mäusen, Handhabung und Genotypisierung.

Alle Tiere wurden mit größter Sorgfalt, die Minimierung von Schmerzen oder Beschwerden während des Verfahrens behandelt. Dieses Verfahren folgt den Richtlinien der Tierbetreuung unserer Institution und die Lokalkomitees (Regierungspräsidium Darmstadt, Zulassungsnummer FK/1044) genehmigt wurde.
Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der Arbeitsschritte für in Vivo Durchlässigkeit Assay bei Mäusen. Die Details der einzelnen Schritte werden im...

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	<li>Abbott, N. J., R&#246;nnb&#228;ck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Dysfunction+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. 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Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+efflux+of+amyloid-&#946;+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis.">Increased efflux of amyloid-&#946; peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li><li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer's+disease.">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li><li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li><li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling.">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li><li>Scholz, A., Harter, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption:+roles+of+cyclooxygenase,+oxidative+stress,+neuroinflammation,+and+elements+of+the+neurovascular+unit.">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).</li><li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+claudins.">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li><li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+Role+of+Brain+Endothelial+Surface+Charge+and+Glycocalyx.">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li><li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+effects+of+the+blood-brain+barrier+on+the+transport+of+charged+molecules.">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li><li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells.">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li><li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose.">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li><li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier.">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li></ol>

Funktionsstörung der Blut - Hirn-Schranke ist verbunden mit einer Reihe von neurologischen Erkrankungen, einschließlich primäre und sekundäre Hirntumoren oder Schlaganfall. BBB Aufschlüsselung ist häufig verbunden mit lebensbedrohlichen CNS Ödem. Daher ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Öffnung auslösen oder Schließung der BBB therapeutische Bedeutung bei neurologischen Erkrankungen und häufig von Forschern untersucht. BBB Permeabilität in Vivo in der Literatur beschrieben sind ...

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) besteht aus der mikrovaskulären Endothelzellen (ECs) unterstützt durch eng Perizyten (PCs), sind Ensheathed in der Basallamina und Astrozyten (ACs), die die Basalmembran mit den End-Füßen1 umhüllen ,2. ECs mit mehreren Zelltypen, die unterstützen und regulieren die Barrierefunktion, in erster Linie ACs und PCs interagieren und auch Neuronen und Mikroglia, alle zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden). Die NVU ist entscheidend für die Funktion der BBB, was den Transport von Blut übertragene Giftstoffe und Erreger in das Gehirn gelangen begrenzt. Diese Funktion ist ein Ergebnis der engen Kreuzung Moleküle wie occludin, Claudin-5, Zonula Occludens-1, die zwischen ECs und auch durch die Einwirkung von Transportern wie p-Glykoprotein (P-Gp), dass Fluth Moleküle, die das Endothel geben Sie wieder anwesend sind das Gefäß Lumen1,2,3. Die BBB kann jedoch für den Transport von wesentlichen Moleküle wie Nährstoffe (Glukose, Aminosäuren, Eisen) durch spezifische Transporter zum Ausdruck auf den EC Plasmamembranen1,2,3. Die EG-Ebene ist in Bezug auf die Verteilung der verschiedenen Transporter zwischen der luminalen (Blut-Einfassung) und abluminalen (Gehirn gerichteten Membranen), um die spezifischen und vektorielle Transport Funktion4,5 ermöglichen stark polarisiert. . Während die BBB Schutzmaßnahmen in Bezug auf die streng regulieren das CNS-Milieu ist, ist es eine große Herausforderung für CNS Drug-Delivery bei Erkrankungen wie Parkinson mit einem funktionalen BBB. Auch bei neurologischen Erkrankungen mit BBB-Dysfunktion kann nicht davon auszugehen, dass die Gehirn-Drug-Delivery erhöht wird, zumal die Barriere Dysfunktion Schaden an den spezifischen Transporter Zielen wie zum Beispiel bei Alzheimer-Krankheit (AD) beinhalten könnte. N. Chr. mehrere Amyloid Beta-Transporter wie LRP1, RAGE, P-Gp sind bekanntermaßen Dysregulated und somit gezielt diese Transporter möglicherweise vergeblich6,7,8. Die BBB ist in verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall, AD, Meningitis, Multiple Sklerose, und im Gehirn Tumoren9,10,11beeinträchtigt. Die Wiederherstellung der Barrierefunktion ist ein wesentlicher Bestandteil der therapeutischen Strategie und damit ihre Beurteilung ist entscheidend.
In dieser Arbeit haben wir beschrieben, einen objektiven und quantitativen Protokoll für Durchlässigkeit Assay bei Nagetieren, dass wir erfolgreich, mehrere Mauslinien beide transgene und experimentelle Krankheit Modelle10,12,13 angewendet ,14. Die Methode basiert auf einer einfachen intraperitoneale Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion der Mäuse, die Tracer aus dem vaskulären Fach zu entfernen. Gehirn und andere Organe sind gesammelte Post Perfusion und Durchlässigkeit anhand objektiver und absolute Permeabilität Index anhand der Fluoreszenz-Messungen der Gewebe Homogenates in einem Teller-Reader. Alle rohen Fluoreszenz-Werte werden korrigiert, für den Hintergrund mit Gewebe Homogenates oder Serum von Schein-Tiere, die keiner Tracer erhalten. Reichliche Normierungen sind bei Serum, Serum Fluoreszenz, und das Gewicht des Gewebes, so nachgiebig Durchlässigkeit Index, absoluter und vergleichbare zwischen Experimenten und Gewebetypen ist, im Preis inbegriffen. Für Vergleich zwischen Gruppen zu erleichtern können die absolute Permeabilität Indexwerte leicht Verhältnisse umgewandelt werden, wie wir zuvor12durchgeführt hatte. Gleichzeitig könnten gespeicherte Hemi-Gehirn und Niere für die Tracer Visualisierung durch Fluoreszenz-Mikroskopie10genutzt werden. Die klassischen Fluoreszenzmikroskopie kann wichtige regionale Unterschied in der Durchlässigkeit zu erhalten, wenn auch umständlich durch subjektive Auswahl von Gewebeschnitten und Bilder für eine semi-quantitative Analyse bilden. Die einzelnen Schritte werden im Protokoll vorgestellt und Noten werden bei Bedarf hinzugefügt. Dies bietet die notwendige Informationen für die Durchführung von in Vivo Durchlässigkeit Assay erfolgreich bei Mäusen, die auf andere Kleintiere skaliert werden können. Der Test kann auf viele Arten von Tracern angewendet werden ermöglicht die Ladung und die Größe Durchlässigkeit Bewertung durch eine Kombination von Tracern mit unterschiedlichen Fluoreszenz Spektren gestützt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>D3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>D3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketavet)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline</td>
			<td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldhehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td>prepare a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rat alexa 568</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rat alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua polymount</td>
			<td>Polyscience Inc</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge butterfly needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>387455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1500.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes tissue wipers</td>
			<td>Kimberley-Clark Professional</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well black plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides superfrost plus</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE pestle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electric overhead stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR VOS 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Microm GmbH</td>
			<td>HM 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic perfusion system</td>
			<td>BVK Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers

Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine spezialisierte Barriere, die das Gehirn Mikroumgebung von Giftstoffen und Krankheitserregern in der Zirkulation schützt und pflegt Gehirn Homöostase. Die wichtigsten Sehenswürdigkeiten der Barriere sind Endothelzellen der Gehirn-Kapillaren ergibt sich deren Barrierefunktion aus enge interzelluläre Verbindungen und Efflux-Transporter über die Plasmamembran zum Ausdruck gebracht. Diese Funktion wird durch Perizyten und Astrozyten, die zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden) geregelt. Verschiedene neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit (AD), Hirntumoren eine Beeinträchtigung der BBB Funktion zugeordnet sind. Bewertung der BBB Permeabilität ist daher entscheidend bei der Bewertung der Schwere der neurologischen Erkrankung und den Erfolg der Behandlungsstrategien eingesetzt.
Wir präsentieren hier eine einfache, aber robuste Durchlässigkeit Assay, die auf mehrere Maus erfolgreich angewendet wurden sowohl genetische als auch experimentelle Modelle. Die Methode ist höchst quantitative und Objektive im Vergleich zu den Tracer Fluoreszenzanalyse Mikroskopie, die häufig angewendet wird. Bei dieser Methode werden Mäusen intraperitoneal mit einer Mischung aus wässrigen inert Fluoreszenz Tracer gefolgt von betäuben die Mäuse injiziert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgt vor der Ernte, Gehirn, Nieren oder anderen Organen. Organe sind homogenisiert und zentrifugiert, gefolgt von Fluoreszenzmessung von überstand. Blut aus der Herzpunktion kurz vor Perfusion dient zur Normalisierung soll das vaskuläre Fach. Die Gewebe-Fluoreszenz ist normiert auf die nassen Gewicht und Serum Fluoreszenz zu einer quantitativen Tracer Durchlässigkeit Index. Für zusätzliche Bestätigung sowohl der kontralateralen Hemi-Hirn für Immunohistochemistry bewahrt Tracer Fluoreszenz Visualisierung Zwecke einsetzbar.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) Mäuse höhere Gehirn vaskulären Permeabilität als Kontroll-Mäusen unter gesunden Bedingungen10 haben. Bei Schlaganfall-induzierte Mäusen war es auch zeigt, dass die GOF-Mäuse Infarkt größer und größere Durchlässigkeit als Kontrolle Wurfgeschwistern hatten. Diese Ergebnisse zeigen eine kritische Rolle von Ang-2 in Durchlässigkeit an der BBB. Das Protokoll daher verwendet die ...

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An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

The overall goal of this procedure is to assess the permeability of brain vasculature in mice using fluorescently-labeled tracers to assess blood-brain barrier dysfunction in animal models. This method can help answer key questions in the blood-brain barrier field pertaining to neuro-vascular permeability in diseases and its recovery upon therapy. The main advantage of this method is that it is simple and quantitative.It gives the possibility for concurrent assessment of permeability by fluorometry, which is quantitative, and also fluorescence microscopy for regional defenses. The implications of this technique extend towards diagnosis and therapy of several neurological disorders, including brain tumors, stroke, and Alzheimer's disease because these diseases are associated with life-threatening brain edema and improvement of BBD function as a key therapeutic target. Demonstrating part of the procedure will be Miss Jadranka Macas, a scientific technology officer at the institute.Intraperitoneally inject mice with 100 microliters of two-millimolar tracer solution. Choose lysine-fixable tracers, such as dextrans labeled with FITC and TMR with distinct excitation emission spectra for minimal interference between the dyes. If combining tracers, inject 200 microliters of combined tracer solution intraperitoneally.Include vehicle-only injections to serve as sham controls for autofluorescence background subtraction. After each injection, allow five minutes before deeply anesthetizing the mice according to the approved institutional protocols. Prepare the animals for cardiac perfusion 10 minutes after anesthetic administration.Check the absence of paw twitch response to ensure that the mouse has reached a surgical plane of anesthesia. Lay the mouse to be perfused on its back and apply 80%ethanol on the skin of the abdominal area. After using small scissors to create a two-centimeter incision in the abdominal wall, separate the liver from the diaphragm, and then slowly cut through the diaphragm, exposing the plural cavity.Cut the ribcage bilaterally and fix the cut sternum to expose the left ventricle. Insert a 21-gauge butterfly needle connected to a peristaltic perfusion system in the posterior of the left ventricle. Puncture the right atrium and then use a one-milliliter pipette tip with the end cut off to quickly collect the 200 to 300 microliters of released blood and transfer to a serum collection tube.Store the collected blood on ice. As soon as the blood is collected, switch on the perfusion system and perfuse the animal for three minutes with room temperature calcium and magnesium ion-free PBS. Assess perfusion quality by noting the color of the liver and kidneys, which appear pale after perfusion.After harvesting the brain, verify that there is no blood visible in vessels of the meninges. The sample should be excluded from the permeability analysis if the perfusion quality is poor. Use a scalpel to separate the brain into two hemi-brains.Then dissect the cerebellum and olfactory lobe from one hemi-brain, and transfer the hemi-cerebrum to a two-milliliter tube. Place one harvested kidney to another two-milliliter tube. Immediately place the samples on dry ice.Natively embed the remaining kidney and hemi-brain with cerebellum and olfactory lobes intact in TissueTech optimal cutting temperature compound, and put it on dry ice. Lastly, after centrifuging the blood samples at 10, 000 G for 10 minutes at four degrees Celsius, transfer the serum supernatants to 1.5-milliliter tubes and place them in the dry ice container. Transfer the samples to the minus 80 degrees Celsius freezer as homogenization efficiency increases after freeze-thawing.Place the hemi-cerebrum and kidney samples on ice to thaw, and then weigh the tubes containing the organs. From these weights, subtract the mean value of approximately 20 empty tubes to get the tissue weight. Add 300 microliters of cold PBS to the tube containing kidney and 200 microliters to the tubes containing hemi-cerebrum.Homogenize each sample in the original microfuge tube with a PTFE pestle attached to an electric overhead stirrer, using about 15 strokes. Store the homogenized samples on ice, protected from light. Rinse the pestle with PBS in between samples and wipe dry before proceeding to the next sample.When all samples have been homogenized, centrifuge for 20 minutes at 15, 000 G and four degrees Celsius. Following centrifugation, transfer the supernatants to new 1.5-milliliter tubes on ice before proceeding to fluorescence measurement and quantification. Transfer the supernatant to a 384-well plate and insert the plate into fluorescence reader.Make sure the right excitation and emission wavelengths are included for the tracer and set the gain to Optimal. Start the measurement, and export the data as a spreadsheet to perform the calculations as described in the protocol. On the day of staining, thaw 10-micron cryostat sections mounted on slides at 37 degrees Celsius for 10 minutes.Then, fix the sections with 4%paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature, followed by quick-washing in PBS. Permeabilize and block non-specific binding in the sections by incubating in sterile PBS containing 1%PSA and 0.5%Triton X-100 for one hour at room temperature. After blocking, incubate the slides with a one-to-100 dilution of CD31 primary antibody for 1.5 hours at room temperature.After washing with PBS three times for five minutes each, perform secondary antibody incubation for one hour at room temperature with species-specific fluorescently labeled antibodies. Mount the stained sections with Aqua-Poly/Mount and leave overnight for polymerization at room temperature in the dark. Finally, acquire images using a spectral imaging confocal laser scanning microscope system.In order to establish the tracer circulation time for the permeability assay, a long circulation time of two hours is compared to a short circulation time of 15 minutes post tracer injection. The longer circulation time of two hours leads to low amounts of tracers accumulation in kidney compared to a short 15-minute circulation time potentially due to a high clearance FITC dextran shown in green from the vascular compartment. This effect is even more dramatic in the brain due to the tight blood-brain barrier.CD31 staining seen in the red channel confirmed the presence of vessels in the kidney at both time points examined and in the brain. Once mastered, this technique can be performed within five to six hours for 10 mice with two scientists working in tandem. While attempting this technique, it is important to remember to use tracers of right molecular weight, chart and fluorescence characteristics in order to answer the questions regarding the blood-brain barrier permeability.Following this procedure, other methods like immuno-histochemistry for BBD and disease fill on factors can be performed to answer additional questions, like severity and localization of disease site.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

Ein Assay zur Durchlässigkeit des Zebrafisch-Embryos Neuroepithel

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Beurteilung der Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke durch intravenöse Infusion von FITC-markierte Albumin in einem Mausmodell der Neurodegenerative Erkrankung

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrokortikographische Aufzeichnung von Großhirnrindenbereichen manipuliert mit einem Adeno-assoziierten Virus, das auf Cofilin bei Mäusen abzielt

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Messung des transendothelialen Widerstands zur Beurteilung der Integrität der Zellbarriere

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Autor im Rampenlicht: Anwendungen der TEER-Detektion zur Beurteilung der Integrität der Zellbarriere 

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...