Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), den amerikanske lunge foreningen, The Allegheny Health Network-Johns Hopkins Research Fund og Hopkins fordøyelsessykdommer Basic Research Core Center.

Denne protokollen ble godkjent av Johns Hopkins Medical institusjoner Animal Care og use Committee (IACUC). Denne protokollen er endret fra en tidligere publiserte metoder10,11,12,13.
1. utarbeidelse av reagenser
<ol><li>Forbered frisk 293T mellom flere timer på forhånd og varm til 37 ° c i et vannbad i minst 10 minutter før bruk (tabell 1).</l...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

Primær kultur av voksen intestinal epitel som organoids gir et kraftig verktøy for å studere molekylære mekanismer involvert i Stamcelle funksjon, intestinal epitel homeostase, og patologi1,2,3, firetil. Selv om CRISPR/Cas9-teknologi kan brukes til genetisk ingeniør organoids9, er det begrenset av behovet for omfattende screening og valg basert på sekvens analyse ...

Evnen å kulturen musen eller Human Krypter celler idet tredimensjonal (3D) organoids fra det liten tarmen eller kolon over lengre tid perioder forsynt en større gjennombruddet fordi disse kulturen utfoldelse definerende vise egenskaper av intestinal epitel inne vivo 1 den andre , 2 andre priser , 3. Organoids avledet fra primære Krypter er i stand til selv-fornyelse og selv-organisasjon, viser cellulære funksjoner som ligner på deres vev opprinnelse. Faktisk, organoids recapitulate ikke bare den strukturelle organiseringen av Krypter in vivo, men også mange molekylære funksjoner, og dermed gi nyttige verktøy for å studere normal biologi og sykdom tilstander. For å illustrere, har organoid studier avdekket romanen molekylære trasé involvert i vev gjenfødelse1,2,3,4,5 samt medikamenter som kan forbedre funksjon i patologisk innstillinger6,7.
Studiet av tarm stamceller er av spesiell interesse fordi intestinal fôr er blant de mest regenererende pattedyr vev, fornye seg hver 3-5 dager for å beskytte organismen fra bakterier, toksiner og andre patogener i tarm lumen. Intestinal stamceller (ISCs) er ansvarlig for denne bemerkelsesverdige regenererende evne og dermed gi et unikt paradigme for å studere voksen stilk cellen funksjon1,2. Lineage-tracing eksperimenter i mus demonstrerte at isolerte Lgr5-positive stamceller kan bli kultivert å generere 3D-organoids eller "mini-guts" in vitro der de tett speile sine in vivo kolleger. Organoid kulturer kan også være avledet fra intestinal krypten celle isolerer består av forfedre, ISCs, og Paneth celler, sistnevnte som utgjør epitel nisje celler i vivo. Faktisk har organoid kultur fra primære intestinal krypten celler utviklet seg til en relativt rutinemessig teknikk som er lett å implementere i de fleste laboratorier ved hjelp av allment tilgjengelige reagenser. Denne modellen er også mottagelig for kvantitativ analyse av genuttrykk av RNA-sekvensering (RNA-SEQ) og proteiner av masse massespektrometri, immunhistokjemi, eller immunofluorescent farging2,4,8. I tillegg kan funksjonell genetikk bli studert ved hjelp av gevinst-av-funksjon (Gen overuttrykte eller uttrykk for et aktiverings mutant gen) eller taps-av-funksjon (Gen-deaktivering eller uttrykk for en tap-of-Function-mutant) tilnærminger2.
Viktigere, lav effektivitet og høy toksisitet av standard plasmider DNA eller viral Transduction protokoller med polybrene fortsatt et stort hinder i feltet. Selv om CRISPR/Cas9-teknologien gjør det mulig for presise Genova redigering, krever denne tilnærmingen tidkrevende valg etterfulgt av sekvens validering9. Her presenterer vi en viral Transduction protokoll for primære intestinal organoids som optimaliserer levering av virale partikler ved Bøyning til magnetiske nanopartikler og anvendelse av et magnetisk felt. Viktige endringer i tidligere protokoller4,5,10,11,12,13 og anbefalinger for å forbedre effektiviteten er gitt. Vi beskriver også en tilnærming for å generere frosne seksjoner fra intakt organoids kultivert i 3D-matrigel (heretter referert til som kjeller membran matrise eller matrise) for videre analyse med immunhistokjemi eller immunofluorescent farging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

Intestinal organoid kulturer gir en unik mulighet til å undersøke intestinal stilk cellen og krypten biologi in vitro, men effektive tilnærminger til å manipulere genuttrykk i organoids har gjort begrenset fremgang i denne arenaen. Mens CRISPR/Cas9 teknologi gjør det mulig for presis Genova redigering av celler for organoid generasjon, denne strategien krever omfattende utvalg og screening av sekvens analyse, som er både tidkrevende og kostbart. Her gir vi en detaljert protokoll for effektiv viral Transduction av intestinal organoids. Denne tilnærmingen er rask og svært effektiv, og dermed redusere tid og kostnader iboende i CRISPR/Cas9 teknologi. Vi presenterer også en protokoll for å generere frosne seksjoner fra intakte organoid kulturer for videre analyse med immunhistokjemiske eller immunofluorescent farging, som kan brukes til å bekrefte genuttrykk eller stanse. Etter vellykket Transduction av viral vektorer for genuttrykk eller deaktivering er oppnådd, intestinal stilk cellen og krypten funksjonen kan raskt vurderes. Selv om de fleste organoid studiene benytter in vitro-analyser, kan organoids også leveres til mus for in vivo funksjonell analyse. Videre er våre tilnærminger fordelaktig for å forutsi terapeutiske reaksjoner på narkotika fordi tiden tilgjengelig behandling generelt funksjon av modulerende genuttrykk eller protein funksjon snarere enn å endre det Genova.

Her beskriver vi en rask og svært effektiv Transduction teknikk som utnytter magnetiske nanopartikler eksponert for et magnetisk felt for å levere lentivirus til celler av interesse. Med lett tilgjengelige verktøy, har vi søkt denne tilnærmingen ikke bare å overfører fersk isolert krypten celler (figur 1a), men også for Organoids (figur 2) og andre celler som er ildfaste til mer rutinemessige Transduction tilnærminger. L...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetisk engineering av primær mus intestinal Organoids bruke magnetisk Nanopartikkel Transduction viral vektorer for frossen snitting

Vi beskriver trinnvise instruksjoner til: 1) effektivt ingeniør intestinal organoids ved hjelp av magnetiske nanopartikler for Lenti-eller retroviral Transduction, og, 2) generere frosne seksjoner fra konstruert organoids. Denne tilnærmingen gir et kraftig verktøy for å effektivt endre genuttrykk i organoids for etterforskning av nedstrøms effekter.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Fordi organoider rekapilerer den innfødte strukturelle organisasjonen, samt mange molekylære trekk ved tarmepitel in vivo, tillater denne teknikken oss å studere normal biologi og sykdomstilstander i laboratoriet. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å genetisk konstruere organoider ved hjelp av en svært svært effektiv transduksjon tilnærming med lav cytotoksisitet, og dermed tillater funksjonelle studier av disse genetisk manipulerte organoider. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot terapi for tarmsykdom fordi vi kan utsette intestinale organoider for narkotika og andre midler eller intervensjoner.Denne metoden kan brukes til å studere utviklings- og patologiske prosesser i andre systemer som er mottagelige for organoide kulturer, for eksempel brystvev eller for celler som vokser under standard 2D-forhold. Generelt vil personer som er nye på denne metoden lykkes med transduksjon i vanskelig-å-ingeniør organoider eller andre celler. Vi hadde først ideen til denne metoden da vi opplevde vanskeligheter med å transdusere våre organoider og stamceller.Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk som strukturell tap av organoider kan oppstå hvis prøver ikke behandles riktig under innebyggingsprosessen i kjelleren matrisen for kryoseksjon. For å dyrke organoider for viral transduksjon, frø organoid cellekulturer med 200 mikroliter transduksjon medium per brønn i en 48-brønn plate, og inkubere i en standard vevkultur inkubator. Tin hetteglass med virus for transduksjon, slik at ca 50 mikroliter konsentrert virus for transduksjon av hver brønn i 48-brønnplater.I et 1,5-milliliter rør blander du viruset med 12 mikroliter av en magnetisk nanopartikkelløsning, og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Etter 15 minutter, tilsett den magnetiske nanopartikkelløsningen og virusblandingen til cellene som skal transduseres. Plasser 48-brønnsplaten på en magnetisk plate, og inkuber i en standard vevskulturinkubator i minst to timer.Når virustransfeksjonen er fullført, overfører du de infiserte organoidcelleklyngene og transduksjonsmediet fra hver brønn til et 1,5-milliliter rør. Sentrifuge ved 500 ganger g i fem minutter. Kast supernatanten med skånsom suging, og avkjøl rørene som inneholder pelleten på is i fem minutter.Tilsett 120 mikroliter kjellermembranmatrise til hvert rør, og gjenoppbruk pelleten ved sakte pipettering opp og ned. Frø 30-mikroliter dråper av matrisecelleblandingen til en ny 48-brønns plate. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i fem til 15 minutter til matrisen stivner.Tilsett transduksjonsmedium til hver brønn, og inkuber i en standard vevskultur inkubator i tre til fire dager. Etter tre til fire dager, inspiser kulturene under et lett mikroskop ved 10x forstørrelse for å sikre organisering av celleklynger i organoidstrukturer. Skift forsiktig ut transduksjonsmediet i hver brønn med 250 mikroliter organoidkultur ENR medium.Sett platen tilbake til inkubatoren. Start denne prosedyren ved å fjerne ENR-mediet ved mild suging, vær forsiktig så du ikke perturb kjelleren membran matrise. Vask forsiktig med 500 mikroliter PBS.Fest organoidene ved å legge til en mikroliter på 4% paraformaldehydløsning per brønn, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Etter 30 minutter, fjern paraformaldehydoppløsningen ved suging. Tilsett forsiktig en mikroliter PBS per brønn, og fjern deretter PBS ved skånsom suging.På denne måten, vask to ganger med PBS. Fjern PBS fra den andre vasken, og legg til en mikroliter på 30 % sukrosebuffer i hver prøve. Inkuber de faste organoidene i sukrose i en time ved fire grader Celsius for å dehydrere prøvene.Fjern sukrosebufferen ved suging, og legg til akkurat nok innebyggingsforbindelse for å dekke matriselaget i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Deretter plasserer du prøvene i en minus 80-graders Celsius fryser i 10 minutter eller til innebyggingsforbindelsen blir solid og hvit.Plasser platen med frossen innebyggingsforbindelse ved romtemperatur for å tillate minimal smelting av forbindelsen langs kantene. Bruk en skalpell eller slikkepott for å skille blokken fra veggene i brønnen. Arbeid raskt for å hindre smelting, ved hjelp av tang for å fjerne matriseinnbyggingsforbindelsesblokken, og plasser den i en prøveblokk.Fyll formen helt med innebygging sammensatte. Frys ved minus 80 grader Celsius i 30 minutter før du bruker blokken til snitting. Denne protokollen ble optimalisert ved første transduserende tarmorganoider med lentiviralvektorer knyttet til GFP.GFP ble visualisert på hvert stadium i organoid utvikling, inkludert tidlig når kryptceller organiserer seg i cystelignende strukturer eller senere når organoider danner knopper. Vellykket transdusert intestinal organoider ble deretter formalin-fast, kryoseksjonert, og analysert ved immunofluorescence imaging. I dette bildet er kjerner farget i blått, og det grønne indikerer epitelcelleadhesjonsmolekyler, som avgrenser cellegrenser.Den røde indikerer lysosom farging for å identifisere Paneth celler. Når mestret, kan transducing organoider utføres i ca tre timer, og organoider crysection embedding kan gjøres i ca 2 1 /2 timer. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å jobbe på is når du håndterer kjellermatrisereagenser.Etter å ha fullført denne prosedyren, kan immunofluorescent analyse og andre metoder for å oppdage proteiner eller organeller utføres for å vurdere lokalisering eller relativ overflod. Denne teknikken baner måter for forskere å utforske normal biologi og sykdom tilstander in vitro og også for in vivo studier hvis de transduserte organoider eller celler kan implanteres i mus. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du bruker magnetisk merkede virus til genmodifiserte organoider for kryoseksjon.Ikke glem at det å arbeide med virus kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som bruk av egnet verneutstyr bør alltid utføres når du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generering Primær fibroblastkulturer fra Muse øre og hale Vev

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Vurdering av kardiomyocytt DNA syntese og ploidiundersøkelse: En metode for å hjelpe Kvantifisering av kardiomyocytt Regeneration og Omsetning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Bruke Primære neurosfærekulturer å studere Primær Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende merking av piskehale som henger og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmen Tissue og 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Sanntids måling av epitelial barriere permeabilitet i menneskelig Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generasjon av Organoids fra mus Extrahepatic galle kanaler

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av flercellede Human Primary livmor Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk tracing bruke konfetti musen til å studere Mineralisert vev

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulating patte-til-avvenning overgang in vitro bruker fosterets intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monocular visuell deprivasjon og okulær dominans plasticity måling i musen primære visuelle cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...