Name: investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation at JoVE.com

A Fundação Lundbeck, Universidade de Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s com suporte a este trabalho.

Nota: Executar todas as etapas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário e manter buffers no gelo ou na geladeira (exceto a partir da eluição de buffer contendo SDS). O protocolo é dividido em 5 seções: amostras de preparação do RNA; preparação dos grânulos para IP; ligação do RNA BrU-rotulados de grânulos; eluição e purificação do RNA acoplado com rótulo BrU, pela extração de fenol-fenol/clorofórmio-clorofórmio 3 passos; análise do RNA (no exemplo usando RT-qPCR)
<p class="jove_...

<ol>
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Este protocolo descreve o uso de BrU-IP para determinação da produção de RNA pela rotulagem dos recém produzido RNA 1 h com BrU, seguido pela extração de RNA imediata e imunoprecipitação de RNA com rótulo BrU. Este método tem sido descrito anteriormente na referência16, e este artigo inclui algumas etapas adicionais para aumentar a especificidade do IP e pureza de RNA, por grânulos de pré-tratamento com baixas concentrações de BrU, bem como uma etapa de purificação de fenol-cloro...

5-Bromouridine (BrU) imunoprecipitação (IP) permite o estudo da produção de RNA em células com n ou efeitos muito limitados na fisiologia de células durante o breve período1,2de rotulagem. O método baseia-se a incorporação do derivado sintético uridina BrU em RNA recém sintetizado seguido pelo IP do RNA rotulado usando anticorpos anti-BrU (Figura 1).
Tem sido conhecido por décadas a síntese de proteínas pode ser transcriptionally regulado, e a existência de factores de transcrição foi hipotetisada há mais de 50 anos3. Hoje, é conhecido que várias doenças são causadas pela desregulação de transcrição e a estabilidade do RNA (S1 Figura complementar em referência4), e a capacidade de medir as mudanças na produção do RNA é de grande importância na doença de compreensão desenvolvimento.
Por outro lado, ferramentas para regular a produção de RNA fornecem novas possibilidades para o tratamento de doenças causadas pela expressão de proteína muito pouco ou demais, ou acúmulo de proteína, como na doença de Parkinson (PD). A proteína predominante acumulando agregados como insolúveis em PD é α-synuclein, e o nível de α-synuclein está diretamente ligado à doença, como a multiplicação de gene do gene da α-synuclein causa familiar PD5. Além disso, α-synuclein agrega de forma dependente de concentração. Downregulation dos níveis de mRNA de α-synuclein, portanto, é uma estratégia terapêutica interessante, que tem sido conseguida com êxito usando a interferência do RNA para diminuir a perda de célula neuronal em modelos de roedores de PD6,7.
É importante ser capaz de medir as mudanças na produção de RNA causada por doença ou intervenções terapêuticas. Métodos de última geração para medição níveis de estado estacionário de RNA, como a transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), não são capazes de distinguir entre alterações causadas por regulamento transcriptional ou alterados Estabilidade do RNA. Um método amplamente utilizado para a investigação de taxas de decaimento de RNA está bloqueando da maquinaria transcricional usando compostos tais como α-amanitin ou actinomicina D, seguido por medições de RNAs os decadentes. No entanto, existem alguns problemas associados com um bloqueio geral da transcrição em células, como a indução de apoptose8,9. Ao lado dos efeitos citotóxicos, inibidores transcriptional também apresentam vários problemas técnicos, como a lenta absorção celular de α-amanitin e falta de especificidade de actinomicina D (revisto em referência10).
Para evitar o bloqueio total da transcrição, têm sido utilizados análogos de nucleotídeos, tais como uridina 5-ethynyl (5-UE), 4-thiouridine (TU-4) e BrU. Estes são prontamente ocupados por células de mamíferos e incorporadas RNA recém sintetizado, permitindo pulso-rotulagem do RNA dentro de um intervalo de tempo específico. BrU é menos tóxico do que o 5-UE e 4-TU, tornando-se o preferido análogo escolha11,12.
BrU-IP pode ser usado para investigar tanto a taxa de síntese de RNA e estabilidade e, portanto, distinguir entre as causas de alterações no RNA total. Este artigo incidirá sobre a medição de síntese de RNA e refere-se a referência2 para obter detalhes sobre a investigação da estabilidade do RNA. Para investigar a síntese do RNA, as células são brevemente rotuladas com BrU , por exemplo, para 1 h, seguido por BrU-IP1 (Figura 1). Isso permite que as medições do RNA sintetizado no curto prazo rotulagem e mudanças observadas dará uma melhor estimativa de regulamentos na síntese de RNA do que através da medição de alterações no RNA total por RT-qPCR. Deve ser mencionado, no entanto, que, apesar do tempo de rotulagem, por exemplo, apenas 1 h, degradação ainda pode ter uma influência sobre os níveis de RNA observada.
RNA de experimentos de BrU-IP são adequados para análise a jusante por tanto RT-qPCR1 ou próxima geração sequenciamento2,13. Outros métodos de detecção de RNA padrão, tais como a mancha do Norte ou ensaio da proteção ribonuclease, podem também ser aplicáveis para certos RNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ribolock Rnase inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11202D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bromodeoxyuridine mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Ultraviolet-visible spectrophotometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Saturated Phenol pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure RNA isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman RNA probes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td>
			<td>Flurogenic probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR system</td>
			<td colspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer supplemented with 1 &#956;g/&#956;L BSA and 80 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrU-IP+ 1 mg/mL heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1xBrU-IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 &#956;g/&#956;L BSA and 20 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% SDS in RNAse-free H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation

Quando os níveis de estado estacionário do RNA são comparados entre duas condições, não é possível distinguir se as alterações são causadas por alterações na produção ou degradação do RNA. Este protocolo descreve um método para a medição da produção de RNA, usando 5-Bromouridine de rotulagem do RNA seguido por imunoprecipitação, que permite a investigação do RNA sintetizado dentro de um curto espaço de tempo (por exemplo, 1 h). A vantagem de 5-Bromouridine-rotulagem e imunoprecipitação sobre o uso de inibidores de transcriptional tóxicos, tais como α-amanitin e actinomicina D, é que não há nenhum ou muito baixos efeitos na viabilidade celular durante o uso a curto prazo. No entanto, porque 5-Bromouridine-imunoprecipitação captura apenas RNA produzido dentro do tempo curto de rotulagem, lentamente produzido, bem como rapidamente degradada RNA pode ser difícil de avaliar por esse método. O RNA 5-Bromouridine-rotulados capturado por imunoprecipitação-5-Bromouridine pode ser analisado por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa na próxima geração de sequenciamento. Todos os tipos de RNA podem ser investigados, e o método não está limitado a medição do mRNA, tal como é apresentado neste exemplo.

Nossos testes iniciais de tempo BrU-rotulagem foram realizados em células AsPC-1. As células foram tratadas com BrU para 0, 1, 2 e 4,5 h, seguido por extração de RNA total e BrU-IP. GAS5 e GAPDH foram medidos em BrU-IP do RNA, que demonstrou que a rotulagem de 1h foi suficiente para atingir uma aproximadamente 9 - e 44 vezes mudança em relação ao fundo (h 0) GAPDH e GAS5, respectivamente.
BrU-IP e a análise descrita acim...

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Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Esse método pode ser usado para medir a síntese do RNA. 5-Bromouridine é adicionado às células e incorporado na RNA sintetizado. Síntese de RNA é medido pela extração do RNA imediatamente depois da rotulagem, seguido de 5-Bromouridine-alvo da imunoprecipitação de rotulados RNA e análise por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa.

Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Microarrays de DNA e RNA de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...