Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

تم تأسيس هذا العمل قبل الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) ضمن المنح CO822/2-1 (برنامج إيمي نويثر) و CO822/3-1 إلى جيم

1-الأسفار على أساس الفرز لإدماج الكفاءات (الشكل 1)
<ol><li>الحفاظ على خلايا HEK293 في المتوسط "تعديل النسر" دولبيكو (دميم؛ الجلوكوز عالية، 4 مم الجلوتامين، بيروفات) وتستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% و...

ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة وموثوق بها تقييم الكفاءة لأزواج متعامد لإدماج ncAAs في البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب فيما يتعلق بالاختبارات المستخدمة على نطاق واسع يستند إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية هو أنه يسمح بإعداد المتزامنة وقياس لعدد أكب...

إدماج المجسات الكيميائية الوراثية في البروتينات وسيلة قوية لتسهيل التحقيق في الجوانب الهيكلية والديناميكية لوظيفة البروتين مباشرة في سياق الأصلية من الخلية الحية. في الوقت الحاضر، مئات أحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) مجهزة بمجموعات كيميائية الأكثر المتباينة يمكن سيتيسبيسيفيكالي إدراجها في البروتينات تخليق الحيوي1،2،،من34. بينهما، يجد المرء ncAAs المراعية للصور مثل الصور-كروسلينكيرس5و صور قفص6،7،،من89 والأحماض الأمينية-صور للتحويل10، 11، والأحماض الأمينية التي تحمل الالكينات المتوترة والكينس بيورثوجونال خالية من محفز الكيمياء2،،من1213،14،15،16 ،17والأحماض الأمينية التي تحمل دانسيل18و9،الكومارين19و21 برودان20،فلوروفوريس، ومجهزة بالمسابير الفيزيائية الحيوية الأخرى الأحماض الأمينية وكما هو الحال مع وظيفة التعديلات متعدية الجنسيات1،2،3،4،،من2223،24،25.
يتم تمكين الترميز الوراثي من نكا مخصصة أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) إقران إلى المشابهة القامع-الحمض الريبي النووي النقال، الذي يتضمن نكا ردا على كودون وقف العنبر خلال التوليف ريبوسومال العادية. أزواج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال صممت كي يكون متعامد في الكائن المضيف، أي لا عبر الحديث مع أزواج الذاتية. هذا الأسلوب راسخة في المضيفين بدائية وحقيقية النواة والخلايا تنطبق بسهولة على الثدييات. أزواج لإدماج نكا في خلايا الثدييات تستند إلى نظم متعامد الرئيسية الثلاثة: النظام تيروسيل، الذي يجمع بين تيرس من كولاي26 مع القامع العنبر تيروسيل من ستيروثيرموفيلوس باء-27 (Ec تيرس/زوج يامبتوقيت جنوب بريطانيا)، كولاي ليوسيل نظام (المفوضية الأوروبية/الحمض الريبي النووي النقاللويكوا زوج)6،،من1828 ونظام بيروليسيل أرتشايال (بيلرس/الحمض الريبي النووي النقال برونتوسوروس زوج)3، الذي بموجبه الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس القامع العنبر طبيعي. وبصفة عامة، كل نكا يعترف به نكارس متخصصة. اعتماداً على هيكل ncAA، يتم الحصول عليها في نكارس عن طريق التطور الموجه تيرس أو التي أو بيلرس، على الرغم من أن بعض سينثيتاسيس يمكن قبول أكثر من الرابطة الوطنية لرياضة.
يتم استيراد الزوج متعامد إلى الخلايا ببساطة استخدام ناقل بلازميد. والبلازميدات الأكثر شيوعاً وكفاءة بيسيسترونيك وترميز سواء بالنسبة سينثاتيز والحمض الريبي النووي النقال تشكيل زوج متعامد29. ترميز بلازميد الثاني لبروتين فوائد كودون العنبر في موقع مخصص للتعديل ترانسفيكتيد المشترك. نكا بساطة إضافة إلى متوسط نمو الخلية. ومع ذلك، غالباً ما تستخدم مختلف المجموعات المتخصصة أنواع مختلفة من بنيات بلازميد حتى بالنسبة لإدماج نكا نفس. بنيات تختلف في ترتيب الجينات في ناقلات، نوع من سينثاتيز كودون الاستخدام في الجينات سينثاتيز، استخدام المروج، والبديل للحمض الريبي النووي النقال وعدد الأشرطة التعبير الحمض الريبي النووي النقال. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تختلف فعالية إدماج ncAAs مختلفة جذريا بسبب كفاءة الحفاز مختلفة سينثيتاسيس مختلفة، ونوعية الحمض الريبي النووي النقال، و العوامل الأخرى30. ولذلك، من المهم أن يكون في متناول اليد طريقة سريعة وموثوق بها لتقييم كفاءة زوج متعامد، سواء في اختيار النظام الأكثر ملاءمة لتطبيق المطلوب والقيام ببعض خطوات التحسين التي تحسن عموما البروتين التعبير غلة.
وقد أنشأنا بسيطة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد29 (الشكل 1). في التحليل، خلايا transfected اشتركت مع بلازميد الترميز لزوج متعامد، جنبا إلى جنب مع بلازميد مراسل بيسيسترونيك ترميز سواء بالنسبة للبروتينات الفلورية الخضراء واضعة كودون وقف العنبر في موقف متساهلة (اجفبالعلامة) مشري الجينات. تتم قراءة الأسفار الحمراء والخضراء لكامل الخلية ليساتيس في قنوات منفصلة عن قارئ لوحة في لوحة 96-جيدا. كثافة الفلورية الخضراء مباشرة يرتبط بالكفاءة لقمع العنبر، حين يعطي كثافة ومضان أحمر تقدير حجم العينة المقاسة وكفاءة تعداء مباشرة. فيما يتعلق بفحوصات مماثلة تستند إلى الأسفار تلا مساعدة الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)32من31،، المقايسة يعطي تقييما فوريا وشاملاً للتعبير البروتين في السكان خلية كله، الذي أكثر تمثيلية من الظروف التجريبية المعتادة، ويقدم أكثر سهولة الحصول على البيانات وتجهيز مع البرامج القياسية. عموما، الميزة الرئيسية للفحص أنه وسيلة لعدد كبير من العينات يمكن تحليلها بالتوازي. استخدام هذا الفحص، ونحن قد فحص مكتبة مصممة بطريقة رشيدة من ترنس القامع لتحسين كفاءة نظام متعامد برونتوسوروس30. ويصف هذا العمل البروتوكول التجريبي القيام بهذا التحليل وإظهار أمثلة على تطبيقه، بما في ذلك الاستفادة المثلى زوج متعامد لإدراج الصور-كروسلينكينج نكا فأزيدو-L-فينيلالاناين (العازي) ومقارنة إدماج الكفاءات من الأحماض الأمينية مختلفة (الشكل 2).
على مدى السنوات الماضية، ثبت نكا أدوات قوية جداً للتحقيق في الهيكلية والجوانب الفنية للبروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)33،34،35،،من3637 , 38-في البشر، وتكوين أسرة كبيرة من الغشاء مستقبلات (800 عضو) جبكرس وتمثل الأهداف الرئيسية للعقاقير العلاجية. الوصف الهيكلي مباشرة من جبكرس لا تزال صعبة وأساليب البيوكيميائية التكميلية العالية اللازمة للتحقيق فيها. نحن رائدة استخدام ncAAs كروسلينكينج صور لخريطة GPCR السطوح واكتشاف يجند ملزمة جيوب34. استخدام نظامنا الأمثل لإدماج عُزي، ادخلنا بانتظام عُزي عبر المجال جوكستاميمبراني كله من هذه العملية مباشرة في خلايا الثدييات الحية. عند إشعاع الأشعة فوق البنفسجية، عُزي أشكال أنواع نيتريني شدة رد الفعل الذي يلتقط الجزيئات المجاورة تساهمي. عندما تتم إضافة يجند للنظام، عُزي بمثابة تحقيق قرب تكشف فيها مواقف المستقبلات تقترب من يجند منضم. وبهذه الطريقة، وضع الربط من هرمون نيوروبيبتيدي أوروكورتين (Ucn1) على مستقبلات فئة GPCR ب كورتيكوتروبين-تحرير-عامل الكتابة 1 (CRF1R)33 كان أول كشف النقاب عنها. في الآونة الأخيرة، ونحن كشفت عن أنماط ملزمة مميزة ليضع والخصوم على مستقبلات نفس38. طبق نهج مماثل قبل الآخرين للكشف عن أورثوستيريك ومواقع ربط اللوستيريك الأخرى الببتيدات والجزيئات الصغيرة يغاندس على الأخرى جبكرس39،40،،من4142. ويصف هذه المخطوطة البروتوكول التجريبي المطبق في لدينا مختبر لرسم خرائط الصور-كروسلينكينج للسطوح GPCR. الطريقة سريعة نسبيا، واضحة ولا يتطلب أي معدات خاصة، حيث أنها تنطبق في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية. الأهم من ذلك، يوفر هذا النهج أداة قيمة ليس فقط لتحديد مواقع الربط يجند فيها البيانات الهيكلية 3D نادرة، ولكن أيضا تكملة الموجودة في المختبر البيانات مع معلومات من مستقبلات معدلة تماما بوستترانسلاتيونالي في البيئة الفسيولوجية للخلية الحية.
التطورات الأخيرة في رواية ncAAs تتعلق الجانب سلسلة مجموعات كيميائية مناسبة للكيمياء بيورثوجونال خالية من محفز فائق السرعة قد فتحت إمكانية تثبيت fluorophores الجيل الأخير لتصوير فائقة القرار إلى البروتينات مباشرة على يعيش الخلايا2،43. وتشمل هذه المراسي الكيميائية سيكلوكتيني المتوترة في سكوك14، نونيني بيسيكلو [6.1.0] في12،بكنك17، وعبر-سيكلوكتينيس في تكلفة الامتلاك الكلية * ك13،،من1517 من بين ncAAs أخرى إيواء نوربورنيني16،17،44 أو سيكلوبروبيني45،46 moiety. NcAAs ضخمة للكيمياء بيورثوجونال مدرجة بالبديل من بيلرس وعادة ما تتم الإشارة إليها بيلرسAF (يشير إلى الطفرة Y271A و Y349F في بيلرس م. باركيري )، فضلا عن الأخرى المخصصة تطورت نكارس17 , 44-المراسي بيورثوجونال تتفاعل مع تيترازيني الكواشف47 عبر سيكلواديتيون ديلز-الدر معكوس إلكترون-الطلب إعطاء غلات التوسيم عالية ضمن بضع دقائق43،48. بيد قد تم الطعن في تطبيق هذا النهج قوية إلى التسمية جبكرس سبب منخفضة كفاءة الكلية للنظام نكا متعامد على إدراج. استخدام نظامنا برونتوسوروس المعززة، أظهرنا مؤخرا إدماج عالية الغلة من هذه الأحماض الأمينية في جبكرس وفائق السرعة هذه العملية وضع العلامات على سطح خلايا الثدييات يعيش30. مستقبلات المسمى كانت لا تزال وظيفية، كما أنها تستوعب الفيزيولوجية عند تنشيط المستقبلات مع مؤثر. المراسي البروتوكول التجريبي لإدراج بيورثوجونال في جبكرس والخطوات وضع العلامات التالية التي تم وصفها هنا. تجهيز جبكرس مع فلوروفوريس مشرق الصغيرة هو الخطوة الأساسية الأولى باتجاه دراسة ديناميات GPCR الهيكلية في الخلية الحية عبر تقنيات متقدمة في الفحص المجهري.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

إدراج الوراثية من الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) عن طريق قمع كودون وقف العنبر تقنية قوية لتثبيت المجسات مصطنعة ومويتيس رد الفعل على البروتينات مباشرة في الخلية الحية. هو إدماج كل نكا مكرسة متعامد القامع-الحمض الريبي النووي النقال/أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) زوج التي يتم استيرادها إلى الكائن الحي المضيف. يمكن تختلف كفاءة إدماج ncAAs مختلفة إلى حد كبير، وغير مرضية في بعض الحالات. ويمكن تحسين أزواج المتعامدة عن طريق التلاعب AARS أو الحمض الريبي النووي النقال. ومع ذلك، التطور الموجه للحمض الريبي النووي النقال أو AARS استخدام مكتبات كبيرة وأساليب الاختيار الميت/على قيد الحياة ليست ممكنة عمليا في خلايا الثدييات. ويرد هنا، سهلة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد في خلايا الثدييات. يسمح الفحص فحص عشرات ومئات متغيرات AARS/الحمض الريبي النووي النقال بجهد معتدل وضمن فترة زمنية معقولة. استخدام هذا التحليل لتوليد ترنس الجديدة التي تحسن كفاءة نظام متعامد بيروليسيني هو وصف، جنبا إلى جنب مع تطبيق ncAAs لدراسة البروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، التي تشكل تحديا الكائنات للرابطة الوطنية لرياضة الطفرات. أولاً، من خلال دمج بانتظام نكا صور--كروسلينكينج في جميع أنحاء سطح مستقبلات الخلية، يتم تعيين مواقع الربط من يغاندس مختلفة على مستقبلات سليمة مباشرة في الخلية الحية. الثانية، بتضمين ncAAs الجيل الأخير هذه العملية، فائق السرعة مجاناً محفز مستقبلات وسم بصبغة فلورسنت ويتجلى، الذي يستغل بيورثوجونال تروج لها سلالة معكوس "الدر ديلس" سيكلواديتيون (سبيداك) في الخلية الحية. كما يمكن تطبيق ncAAs عموما أي البروتين بشكل مستقل في حجمه، الأسلوب للمصلحة العامة لعدد من التطبيقات. وباﻹضافة إلى ذلك، إدراج نكا لا يتطلب أي معدات خاصة، ويتم بسهولة في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية.

الخطوط العريضة للمقايسة الأسفار هو مبين في الشكل 1. الإنزيم يعمل في ثلاثة طلبات. في المقام الأول، يتم فحص عدد من المتغيرات الحمض الريبي النووي النقال لإدماج Lys(Boc) بزوج متعامد برونتوسوروس. Lys(Boc) هو من الأحماض الأمينية ستيريكالي مماثلة إلى برونتوسوروس. برونت...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

يرد مقايسة fluorescence سهلة لتقييم كفاءة أزواج الأمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز/الحمض الريبي النووي النقال دمج البروتينات في خلايا الثدييات غير المقبول-الأحماض الأمينية (ncAAs). ويرد وصف تطبيق ncAAs لدراسة مستقبلات مقترنة بالبروتين G (جبكرس)، بما في ذلك رسم الخرائط crosslinking صور لربط المواقع ووسم هذه العملية بيورثوجونال على الخلايا الحية.

تحسين إدماج الجينية الكيميائية تحقيقات في جبكرس لرسم خرائط الصور-crosslinking والكيمياء بيورثوجونال في خلايا الثدييات الحية

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

بسيط وبروتوكول السريع لقياس الدهون في خلايا الطحالب المحايدة عن طريق الإسفار

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

ترسيب الأبخرة الكيميائية لمغناطيس العضوي، والفاناديوم تيتراسيانويثيلين

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

تجميد البيولوجية الحفازة متعدد في الخرز الجيني للالعامل المساعد تجديد وتحسين إعادة استخدام

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

إعداد وخصائص الحرارية عكسية عبر ربط الكيمياء المطاط عن طريق ديلز-ألدر

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

نظرة ثاقبة لتفاعلات الأحماض الأمينية والببتيدات مع المواد غير العضوية عن طريق جزيء واحدة قوة التحليل الطيفي

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

إعداد وتقييم<sup&gt; 99m</sup&gt; ح المسمى ثلاثي الشعب يخلب لما قبل استهداف عن طريق Bioorthogonal الكيمياء

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...