Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Dit werk is opgericht door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onder subsidies CO822/2-1 (Emmy Noether programma) en CO822/3-1 I.C.

1. fluorescentie gebaseerde Screening van opneming efficiencyverbeteringen (Figuur 1)
<ol><li>Handhaven van HEK293 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM; hoge glucose, 4 mM glutamine, pyruvaat) aangevuld met 100 U/mL penicilline, 10% (v/v) foetale runderserum (FBS) en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO2.</li>
	<li>Zaad de cellen eergisteren transfectie.<ol>
<li>Loskoppelen van de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C in 0.05% tr...

Het protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare test om te beoordelen van de efficiëntie van orthogonale paren voor de opneming van ncAAs in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. Het belangrijkste voordeel van deze methode met betrekking tot de gebruikte testen op basis van FACS is dat het maakt het mogelijk gelijktijdig voorbereiding en meting van grotere aantallen monsters, en gegevens die gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van een gewone software levert. De beschikbaarheid van een middellange-doorvoer-...

De genetische opneming van chemische sondes in eiwitten is een krachtige methode om onderzoek van structurele en dynamische aspecten van eiwitfunctie rechtstreeks in de oorspronkelijke context van de levende cel. Tegenwoordig kunnen honderden niet-canonieke aminozuren (ncAAs) uitgerust met de meest uiteenlopende chemische groepen worden site-specifically opgenomen in eiwitten door biosynthese1,,2,,3,4. Tussen hen, vindt men lichtgevoelig ncAAs zoals foto-crosslinkers5, foto-caged,6,7,8,9 en foto-schakelbare aminozuren10, 11, aminozuren, rekening houdend met gespannen alkenen en alkynen voor catalyst-gratis bioorthogonal chemie2,12,13,14,15,16 ,17, uitvoering dansyl18en cumarine9,19prodan20,21 fluorophores aminozuren en aminozuren uitgerust met andere biofysische sondes als goed zoals met post vertalende wijzigingen1,2,3,4,22,23,24,25.
De genetische codering van een ncAA is ingeschakeld door een toegewijde amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) gekoppeld aan een cognaat suppressor-tRNA, waarin de ncAA in reactie op een amber stop codon tijdens de reguliere ribosomal synthese. ncAARS/tRNA paren zijn ontworpen zodanig orthogonale in het ontvangende organisme, dat wil zeggen niet cross-talk met de endogene paren. De techniek is goed ingeburgerd, zowel in de prokaryote en eukaryote hosts en gemakkelijk toepasbare aan zoogdieren cellen. Paren voor ncAA opneming in zoogdiercellen zijn gebaseerd op de drie belangrijkste orthogonale systemen: het tyrosyl-systeem, dat de TyrRS van E. coli26 met een suppressor tyrosyl amber van B. stearothermophilus27 (EG combineert TyrRS /BstYam paar), de E. coli leucyl systeem (EGLeuRS/tRNALeuCUA paar)6,18,28 en de archaeële pyrrolysyl systeem (PylRS/tRNA Pyl paar)3, waarbij het tRNAPyl is een natuurlijke amber suppressor. In het algemeen wordt elke ncAA herkend door een gespecialiseerde ncAARS. Afhankelijk van de structuur van de ncAA, wordt de ncAARS verkregen via gerichte evolutie van TyrRS, LeuRS of PylRS, hoewel sommige synthetases meer dan één ncAA kunnen aanvaarden.
Door eenvoudig met behulp van een plasmide vector wordt de orthogonale paar ingevoerd in de cellen. Meest voorkomende en efficiënte plasmiden zijn bicistronic en coderen van zowel voor de synthetase en de vorming van de orthogonale paar29tRNA. Een tweede plasmide-codering voor de proteïne van rentedragende een amber codon op de site voor wijziging aangewezen is mede-transfected. De ncAA is gewoon toegevoegd aan het groeimedium cel. Echter, verschillende gespecialiseerde clientgroepen gebruiken vaak verschillende varianten van plasmide constructies zelfs voor de opneming van de dezelfde ncAA. Constructies verschillen in de rangschikking van de genen in de vector, de aard van de synthetase, de codon gebruik in de synthetase gen, de promotor gebruik, de variant van het tRNA en aantal tRNA expressie cassettes. Bovendien kan de efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs drastisch variëren als gevolg van de verschillende katalytische efficiëntie van de verschillende synthetases, de kwaliteit van het tRNA, en andere factoren-30. Daarom is het belangrijk om bij de hand hebben een snelle en betrouwbare methode om te evalueren van de doeltreffendheid van een orthogonale paar, zowel om te kiezen van het meest geschikte systeem voor een gewenste toepassing en voor het uitvoeren van sommige optimization stappen dat verbetering van de algehele eiwit expressie opbrengsten.
We hebben een eenvoudige en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling om te evalueren van de doeltreffendheid van orthogonale paren29 (Figuur 1) opgericht. In de analyse, cellen zijn mede transfected met de plasmide-codering voor de orthogonale paar, samen met een bicistronic verslaggever plasmide codering zowel voor de groen fluorescente proteïne, rekening houdend met een amber stop codon op een tolerante positie (EGFPTAG) en de mCherry gen. Rode en groene fluorescentie van geheel-cel lysates worden gelezen in afzonderlijke kanalen op een afleesapparaat in een 96-wells-plaat. De intensiteit van de groene fluorescentie direct correleert met de efficiëntie van amber onderdrukking, overwegende dat de intensiteit van de rode fluorescentie een directe schatting van de grootte van het te meten monster en de efficiëntie van de transfectie geeft. Met betrekking tot soortgelijke testen op basis van fluorescentie voorlezen geassisteerde cell sorting (FACS)31,32, de bepaling geeft een onmiddellijke en uitgebreide beoordeling van eiwit expressie in de cel van de hele bevolking, die meer is representatief zijn voor de gebruikelijke proefomstandigheden, en biedt een eenvoudiger data acquisitie en verwerking met standaard software. Globaal, is het belangrijkste voordeel van de bepaling dat een middellange tot een groot aantal monsters kan worden geanalyseerd in parallel. Met behulp van deze test, hebben wij een rationeel ontworpen bibliotheek van suppressor-tRNAs ter verbetering van de efficiëntie van de Pyl orthogonale systeem30gescreend. Dit werk beschrijft het experimentele protocol om het uitvoeren van deze test en voorbeelden van de toepassing ervan, met inbegrip van de optimalisering van de orthogonale paar voor de opneming van de foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanine (Azi) en de vergelijking van de efficiëntie van de integratie van verschillende aminozuren (Figuur 2).
De laatste jaren heeft ncAA tools hebben bewezen zeer krachtig te onderzoeken van structurele en functionele aspecten van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs)33,34,35,,36,,37 , 38. bij de mens, GPCRs vormen een grote familie van membraan receptoren (800 leden) en hoofddoelen voor therapeutische drugs vertegenwoordigen. Directe structurele karakterisering van GPCRs is nog uitdagend en complementaire biochemische methoden zijn zeer nodig voor hun onderzoek. We hebben een pionier in het gebruik van foto-crosslinking ncAAs kaart GPCR oppervlakken en ontdek ligand bindende zakken34. Via ons geoptimaliseerde systeem voor Azi inbouw, wij stelselmatig Azi opgenomen in het domein van de hele juxtamembrane van een GPCR rechtstreeks in de cellen van levende zoogdieren. Bij UV-bestraling vormt Azi een zeer reactieve nitrene soorten die covalent naburige moleculen vangt. Wanneer de ligand wordt toegevoegd aan het systeem, fungeert Azi als een sonde van de nabijheid te onthullen welke posities van de receptor komen dicht bij de afhankelijke ligand. Op deze manier werd de bindende wijze van het neuropeptide hormoon Urocortin (Ucn1) op de klasse B GPCR corticotropin-releasing-factor receptor itype 1 (CRF1R)33 voor het eerst onthuld. De laatste tijd hebben we verschillende bindende patronen van agonisten en antagonisten op de dezelfde receptor38vermeld. Een soortgelijke aanpak is toegepast door anderen te onthullen van de orthosteric en allosteric bandplaatsen van andere peptides en klein molecuul liganden op andere GPCRs39,40,41,42. Dit manuscript beschrijft het experimentele protocol toegepast in ons lab voor foto-crosslinking toewijzing van GPCR oppervlakken. De methode is relatief snel, eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur, zodat zij is van toepassing in standaard biochemie labs. Nog belangrijker is, de aanpak biedt een waardevol instrument, niet alleen om te identificeren ligand bandplaatsen waar 3D Landeninformatie schaars zijn, maar ook ter aanvulling van de bestaande in vitro gegevens met informatie van volledig post-translationally gemodificeerde receptoren in de fysiologische omgeving van de levende cel.
De recente ontwikkeling van roman ncAAs invloed op de kant keten chemische groepen geschikt voor ultrasnelle katalysator-vrije bioorthogonal chemie heeft opengesteld van de mogelijkheid om te installeren van de laatste generatie fluorophores voor super-resolutie beeldvorming in eiwitten direct aan de levende cellen2,43. Dergelijke chemische ankers zijn gespannen cyclooctyne in SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17, en trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 onder andere ncAAs herbergen een Norborneen16,17,44 of cyclopropeen45,46 deel daarvan. Omvangrijk ncAAs voor de bioorthogonal scheikunde middels een variant van de PylRS meestal aangeduid als PylRSAF zijn opgenomen (die aangeeft mutatie Y271A en Y349F in de M. barkeri PylRS), maar ook door andere ad hoc geëvolueerd ncAARSs17 , 44. de ankers van bioorthogonal reageren met tetrazine reagentia47 via omgekeerde elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie geven hoge labeling opbrengsten binnen een paar minuten43,48. Toepassing van deze krachtige aanpak op etiket GPCRs heeft echter zijn uitdagend als gevolg van een lage algemene efficiëntie van de orthogonale ncAA opneming systeem. Via ons uitgebreide Pyl systeem, hebben we onlangs aangetoond hoog rendement opneming van dergelijke aminozuren in GPCRs en ultrasnelle GPCR etiketten op het oppervlak van levende cellen van zoogdieren30. Gelabelde receptoren waren nog steeds functioneel, als ze fysiologisch geïnternaliseerd bij het activeren van de receptor met een agonist. Het experimentele protocol voor de opneming van bioorthogonal ankers in GPCRs en labeling volgt worden hier beschreven. GPCRs met kleine heldere fluorophores om uit te rusten is de eerste essentiële stap naar de studie van GPCR structurele dynamica in de levende cel via geavanceerde microscopie technieken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

De genetische opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) via amber stop codon onderdrukking is een krachtige techniek om te installeren van kunstmatige sondes en reactieve wordt op eiwitten rechtstreeks in de levende cel. Elke ncAA is verwerkt door een speciale orthogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) paar die is geïmporteerd in het ontvangende organisme. De efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs kan sterk verschillen, en in sommige gevallen ontoereikend. Orthogonale paren kunnen worden verbeterd door het manipuleren van de jaarlijkse Activiteitenverslagen van of het tRNA. Gerichte evolutie van tRNA of jaarlijkse Activiteitenverslagen met behulp van grote bibliotheken en dood/levend Selectiemethoden zijn echter niet haalbaar in zoogdiercellen. Hier, wordt een facile en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling aan de evaluatie van de doeltreffendheid van orthogonale paren in zoogdiercellen gepresenteerd. De bepaling kan screening van tientallen tot honderden varianten van de jaarlijkse Activiteitenverslagen/tRNA met een matige inspanning en binnen een redelijke termijn. Gebruik van deze test voor het genereren van nieuwe tRNAs die aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de orthogonale systeem van pyrrolysine wordt beschreven, samen met de toepassing van ncAAs aan de studie van de G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs), die zijn uitdagend objecten voor ncAA mutagenese. Ten eerste, door het systematisch opnemen van een foto-crosslinking ncAA gedurende het extracellulaire oppervlak van een receptor, bandplaatsen van verschillende liganden op de intact receptor worden toegewezen rechtstreeks in de levende cel. Ten tweede, door de integratie van ncAAs van de laatste generatie in een GPCR, ultrasnelle catalyst-gratis receptor labelen met een fluorescente kleurstof wordt aangetoond, die exploiteert bioorthogonal stam-bevorderd inverse Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC) op de levende cel. Als ncAAs kan over het algemeen worden toegepast op elke proteïne onafhankelijk van de grootte, is de methode van algemeen belang voor een aantal toepassingen. Bovendien, ncAA opname niet vereist geen speciale apparatuur en gemakkelijk in standaard biochemie labs wordt uitgevoerd.

De omtrek van de fluorescentie-bepaling is afgebeeld in Figuur 1. De bepaling is werkzaam in drie toepassingen. Op de eerste plaats, worden een aantal tRNA varianten voor opneming van Lys(Boc) door de Pyl orthogonale paar gescreend. Lys(BOC) is een sterically vergelijkbaar met Pyl aminozuur. Zoals Pyl niet commercieel beschikbaar is, wordt Lys(Boc) meestal gebruikt als een standaard substraat voor de PylRS. De afgeschermde tRNAs zijn gebaseerd op het tRNA<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Chemical Vapor Deposition van een organische Magnet, Vanadium tetracyanoethyleen

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Immobilisatie van Multi-biokatalysatoren in Alginaat Kralen voor cofactorregeneratiesysteem en verbeterde Herbruikbaarheid

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

De bereiding en eigenschappen van Thermo-reversibel Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Voorbereiding en evaluatie van<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...