Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

עבודה זו הוקם על ידי דויטשה פתוח (DFG) תחת מענקים CO822/2-1 (אמי נתר תוכנית) ו- CO822/3-1 כדי אי. סי

1. קרינה פלואורסצנטית המבוסס על הקרנת הסרט התאגדות יעילות (איור 1)
<ol><li>לשמור על תאים HEK293 במדיום ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM; גלוקוז גבוהות, גלוטמין 4 מ מ, פירובט) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ב- 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו- 5% CO2.</li>
	<li>הזרע התאים ?...

הפרוטוקול מתאר של assay פשוטה ואמינה כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית כהכנה לסיפוח ncAAs לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היתרון העיקרי של שיטה זו בכל הנוגע בשימוש נרחב מבחני בהתבסס על FACS הוא שזה מאפשר מדידה של מספר גדול של דוגמאות והכנה בו זמנית, מספק נתונים בקלות מאבחנים באמצעות תוכנה ר?...

שילוב גנטי של הגששים כימי לחלבונים היא שיטה חזקה כדי להקל על החקירה של היבטים מבניים ודינאמי של פונקציה של חלבונים ישירות בהקשר מקורית של תא חי. כיום, מאות חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) מצוידים עם הקבוצות כימיים שונים ביותר שניתן site-specifically לשלב חלבונים על ידי ביוסינטזה1,2,3,4. ביניהם, אחד מוצא צילום רגיש ncAAs כגון צילום-crosslinkers5, בכלוב צילום6,-7,-8,-9 חומצות אמינו צילום-להחלפה10, 11, חומצות אמיניות הנושאים מאומצות alkenes ו alkynes bioorthogonal ללא זרז כימיה2,12,13,14,15,16 ,17חומצות אמינו נושאת dansyl18קומרין9,19, fluorophores21 prodan20,, חומצות אמינו מצויד הגששים biophysical אחרים כמו . טוב כמו עם פוסט שינויים translational1,2,3,4,22,23,24,25.
קידוד גנטי של ליגת המכללות מופעלת כברירת ייעודי אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר (AARS) לקשר של cognate משתיק קול-tRNA, אשר משלבת ncAA בתגובה ענבר stop codon במהלך הסינתזה ribosomal רגיל. ncAARS/tRNA זוגות מתוכננים כדי להיות אנכיים בתוך האורגניזם המארח, קרי לא צולבות לדבר עם זוגות אנדוגני. הטכניקה היא מבוססת היטב הן prokaryotic ו האיקריוטים המארחים והן בקלות החלים בתרבית של תאים. זוגות של התאגדות המכללות בתאים בתרבית של מבוססים על שלוש השיטות העיקריות אורתוגונלית: מערכת tyrosyl, המשלב את TyrRS של e. coli26 עם משתיקול ענבר tyrosyl מ- stearothermophilus נולד ב-27 (Ec TyrRS / זוג יםבסט), e. coli leucyl מערכת (EcLeuRS/tRNALeuצ'ואה צמד)6,18,28 ומערכת pyrrolysyl archaeal (PylRS/tRNA Pyl זוג)3, לפיה tRNAPyl זה משתיקול ענבר טבעי. באופן כללי, בכל המכללות מזוהה על-ידי ncAARS מיוחדים. בהתאם למבנה של ncAA, ncAARS, מתקבל באמצעות אבולוציה מכוונת של TyrRS, LeuRS או PylRS, למרות כמה synthetases יכול לקבל ncAA אחד או יותר.
הזוג אורתוגונלית מיובא לתוך התאים על ידי שימוש פשוט וקטור פלסמיד. פלסמידים נפוץ ויעיל ביותר bicistronic, לקודד גם את המעביר וגם את סינתזת ויוצרים זוג אורתוגונלית29. השני פלסמיד קידוד החלבון עניין הנושאת codon ענבר באתר המיועד השינוי הוא transfected משותפת. מדיום הגידול תא פשוט נוסף ncAA. עם זאת, קבוצות מיוחדות שונות מרבים להשתמש וריאציות שונות של פלסמיד בונה גם עבור שילוב של ncAA באותה. מבנים שונים בהסדר של הגנים וקטור, סוג המעביר, השימוש codon המעביר גנים, יזם שימוש, וריאנט של tRNA, מספר קלטות ביטוי tRNA. יתר על כן, היעילות התאגדות של ncAAs שונים יכול להשתנות באופן דרסטי עקב יעילות קטליטי שונים synthetases שונים, על האיכות של tRNA, ועל אחרים גורמים30. לכן חשוב שתהיה בהישג יד שיטה מהירה ואמינה כדי להעריך את היעילות של זוג אורתוגונלית, לבחור את המערכת המתאימה ביותר עבור יישום הרצויה וגם לבצע כמה פעולות אופטימיזציה לשיפור שהביטוי חלבון התשואות.
הקמנו פשוט וחזק מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית29 (איור 1). ב וזמינותו, התאים הם שיתוף transfected עם פלסמיד קידוד בשביל זוג אורתוגונלית, יחד עם פלסמיד כתב bicistronic קידוד הן חלבון פלואורסצנטי ירוק הנושאת של ענבר stop codon במיקום מתירניות (EGFPתג) ו ג'ין mCherry. קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק של כל תא lysates נקראים בערוצים נפרדים על קורא צלחת, צלחת 96-ובכן. עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק להרכב ישירות היעילות של דיכוי ענבר, ואילו עוצמת פלואורסצנטי אדום נותן הערכה ישירה של גודל המדגם נמדד ואת היעילות תרביות תאים. לגבי מבחני דומה המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית תא בסיוע מיון (FACS) לקרוא את31,32, וזמינותו נותן הערכה מיידית ומקיפה של ביטוי חלבון באוכלוסייה התא כולו, אשר יותר הנציגה של תנאי הניסוי הרגיל, ומציע של רכישת נתונים ועיבוד קל יותר עם תוכנה רגילה. בסך הכל, היתרון העיקרי של וזמינותו היא כי ניתן לנתח בינוני למספר רב של דגימות במקביל. שימוש assay הזה, המופרות, ספריה מעוצבת בצורה רציונלית של משתיק קול-tRNAs כדי לשפר את היעילות של מערכת אורתוגונלית Pyl30. עבודה זו מתארת את נסיוני לבצע assay הזה ולהראות דוגמאות של היישום שלה, כולל אופטימיזציה של הזוג אורתוגונלית כהכנה לסיפוח צילום-crosslinking ncAA p-azido-L-פנילאלנין (עזי), השוואת התאגדות היעילות של חומצות אמינו שונות (איור 2).
במהלך השנים האחרונות, כלים ncAA הוכחו רבת עוצמה כדי לחקור מבנה ועל היבטים הפונקציונלית של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. בבני אדם, GPCRs יוצרים משפחה גדולה של קולטני ממברנה (800 חברים) והם מייצגים למטרות טיפוליות סמים. אפיון מבניים ישירה של GPCRs עדיין מאתגר, שיטות ביוכימיות משלימים יש צורך מאוד החקירה שלהם. אנחנו צריכים חלוץ השימוש ncAAs צילום-crosslinking למפות GPCR משטחים ולגלות ליגנד איגוד כיסים34. משתמש שלנו מערכת אופטימיזציה עבור עזי התאגדות, אנחנו באופן שיטתי שולבו עזי לאורך כל juxtamembrane בתחום GPCR ישירות בתאים בתרבית של חיה. בעת הקרנת UV, עזי טפסים זן nitrene תגובתי הלוכד covalently מולקולות שכנות. כאשר המערכת נוספת של ליגנד, עזי משמשת בדיקה קרבה לחשוף אילו עמדות של הקולטן להתקרב ליגנד מאוגד. בדרך זו, מצב איגוד של ההורמון neuropeptide Urocortin (Ucn1) על הקולטן class B GPCR corticotropin שחרור-פקטור שהקלדתי (CRF1R) 133 היה הראשון שנחשף. לאחרונה, חשפנו איגוד ברורים דפוסים של אגוניסטים של היריבים על קולטן זהה38. בגישה דומה הוחל על ידי אחרים כדי לחשוף את orthosteric ואת אתרי קישור allosteric של אחרים פפטידים, מולקולה קטנה ליגנדים על אחרים GPCRs39,40,41,42. כתב יד זה מתאר את נסיוני חלה במעבדה שלנו עבור צילום-crosslinking מיפוי של משטחים GPCR. השיטה היא יחסית מהירה, פשוטה, אינו דורש שום ציוד מיוחד, כך הוא ישים במעבדות לביוכימיה סטנדרטי. חשוב מכך, הגישה מספק כלי חשוב לא רק כדי לזהות אתרי קישור ליגנד שבו נתונים תלת-ממדיים מבניים נדירים, אלא גם כדי להשלים במבחנה נתונים קיימים עם מידע של רצפטורים שונה לחלוטין post-translationally סביבת פיזיולוגיים של תא חי.
ההתפתחות האחרונה של הרומן ncAAs הנושאת על שרשרת צד מתאים כימיה מרביים bioorthogonal ללא זרז כימי הקבוצות נפתחה האפשרות להתקין fluorophores מהדור האחרון עבור הדמיה ברזולוציה סופר לחלבונים ישירות על חיים תאים2,43. עוגנים כימיים לכלול מאומצות cyclooctyne SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17, טרנס-cyclooctenes ב TCO * K13,15,17 בין ncAAs אחרים מחסה של norbornene16,17,44 או cyclopropene45,46 moiety. NcAAs מגושם bioorthogonal כימיה משולבים על-ידי גרסה של PylRS בדרך כלל מסומן בתור PylRSAF (המציין מוטציה Y271A ו- Y349F ב barkeri מ PylRS), וכן על ידי אחרים ncAARSs אד הוק התפתחו17 , 44. עוגנים bioorthogonal להגיב עם ריאגנטים tetrazine47 באמצעות דרישה אלקטרון הופכי cycloaddition תגובת דילס-אלדר לתת תפוקה גבוהה תיוג בתוך כמה דקות43,48. עם זאת, יישום של גישה זו עוצמה לתווית GPCRs מאתגרת עקב היעילות הכוללת נמוכה של מערכת אורתוגונלית התאגדות המכללות. באמצעות המערכת שלנו Pyl משופר, לאחרונה הראו התאגדות לתפוקה גבוהה של חומצות אמינו כזה לתוך GPCRs GPCR מרביים תיוג על פני השטח של תאים בתרבית של חיים30. קולטנים שכותרתו היו עדיין מתפקד, כפי שהם הפנימו פיזיולוגית בעת הפעלת הקולטן עם אגוניסט. פרוטוקול ניסיוני עבור שילוב של bioorthogonal עוגנים לתוך GPCRs, תיוג בשלבים הבאים מתוארים כאן. מצייד GPCRs עם fluorophores בהיר קטן הוא היסוד צעד לקראת לימוד GPCR dynamics מבניים בתא בשידור חי באמצעות טכניקות מתקדמות במיקרוסקופ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

שילוב גנטי של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) דרך ענבר stop codon דיכוי היא טכניקה חזקה להתקין מלאכותי כשמכשיר ורובוט moieties תגובתי על גבי חלבונים ישירות בתא בשידור חי. כל המכללות מעוגנת מאת ייעודי אורתוגונלית משתיק קול-tRNA/אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר (AARS) זוג זה מיובא לתוך האורגניזם המארח. היעילות התאגדות של ncAAs שונים יכול מאוד שונים זה מזה, משביע רצון במקרים מסוימים. זוגות אורתוגונלית יכולים להשתפר על ידי מניפולציה של AARS או של tRNA. עם זאת, אבולוציה מכוונת של tRNA או AARS באמצעות ספריות גדולות ושיטות בחירה המלח/חיה אינם ריאלי בתאי יונקים. כאן, מוצג נתיישב וחזק מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית בתאי יונקים. הבדיקה מאפשרת הקרנת עשרות למאות גרסאות AARS/tRNA עם מאמץ מתון, בתוך זמן סביר. שימוש assay הזה כדי ליצור tRNAs חדשים המשפרים באופן משמעותי את היעילות של מערכת אורתוגונלית פירוליזין מתואר, יחד עם היישום של ncAAs במחקר של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), אשר הם מאתגרים אובייקטים עבור ליגת המכללות מוטגנזה מכוונת. ראשית, משלבים באופן שיטתי של ncAA צילום-crosslinking לאורך כל השטח חוץ-תאי של קולטן, אתרי קישור של ליגנדים שונים על הקולטן שלם ממופות ישירות בתא בשידור חי. השני, על ידי שילוב מהדור האחרון ncAAs GPCR, קולטן ללא זרז מרביים תיוג עם תיוג הפלורסנט הוכח, אשר מנצלת את bioorthogonal זן-קידום הפוך תגובת דילס אלדר cycloaddition (SPIEDAC) על התא בשידור חי. כפי ncAAs ניתן להחיל באופן כללי על כל חלבון באופן עצמאי על גודלו, השיטה היא עניין כללי עבור מספר יישומים. בנוסף, התאגדות המכללות אינו דורש שום ציוד מיוחד, מתבצע בקלות במעבדות לביוכימיה סטנדרטי.

קווי המתאר של קרינה פלואורסצנטית וזמינותו מתואר באיור1. שלושה יישומים מועסק וזמינותו. במקום הראשון, מוקרנים מספר גרסאות tRNA על התאגדות של Lys(Boc) על ידי הזוג אורתוגונלית Pyl. Lys(Boc) היא חומצת אמינו דומה sterically Pyl. כפי Pyl אינו זמין מסחרית, Lys(Boc) משמש בדרך – כלל מצע סט?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

כימית החמקן הפקדת של מגנט אורגני, ונדיום Tetracyanoethylene

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

קיבוע של biocatalysts רב בחרוזים אלגינט עבור פקטור רגנרציה Reusability משופר

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

הכנת המאפיינים של Thermo-הפיך צולב הגומי Via דילס-אלדר לכימיה

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...