Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Quest'opera è stata fondata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sotto sovvenzioni CO822/2-1 (programma di Emmy Noether) e CO822/3-1 a I.C.

1. selezione basata sulla fluorescenza delle efficienze di incorporazione (Figura 1)
<ol><li>Mantenere le cellule HEK293 nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM; alto glucosio, glutamina 4mm, piruvato) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO2.</li>
	<li>Le cellule del seme il giorno prima di transfezione.<ol>
<li>Staccare le cellule per 5 min a 37 ° C in 0.05% tripsina/P...

Il protocollo descrive un'analisi semplice e affidabile per valutare l'efficienza di coppie ortogonali per l'incorporazione di ncAAs in proteine espresse nelle cellule di mammifero. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto al diffusi saggi basati sulla FACS è che permette la preparazione simultanea e la misurazione di un più grande numero di campioni e fornisce i dati che sono facilmente analizzati utilizzando un software ordinario. La disponibilità di un metodo di media-velocità di trasmissione per analizza...

L'incorporazione di genetica di sonde chimiche in proteine è un metodo potente per lo studio degli aspetti strutturali e dinamici di funzione della proteina direttamente nel contesto nativo della cella dal vivo. Al giorno d'oggi, centinaia di aminoacidi non canonico (ncAAs) equipaggiati con i più disparati gruppi chimici possa essere site-specifically incorporato nelle proteine di biosintesi1,2,3,4. Tra loro, si trova ncAAs fotosensibili come foto-reticolanti5, foto-messo in gabbia6,7,8,9 e foto-commutabile aminoacidi10, 11, aminoacidi cuscinetto sforzata alcheni o alchini per bioorthogonal privo di catalizzatore chimica2,12,13,14,15,16 ,17, aminoacidi che trasportano dansile18, cumarina9,19e fluorofori21 prodan20,e aminoacidi con altre sonde biofisiche come nonché con post traduzionale modifiche1,2,3,4,22,23,24,25.
La codifica genetica di un ncAA è attivata da una dedicato amino-acil-tRNA-sintetasi (AARS) abbinata ad un soppressore cognato-tRNA, che incorpora la ncAA in risposta ad un codone di arresto ambra durante la normale sintesi ribosomiale. coppie di ncAARS/tRNA sono progettate in modo da essere ortogonali nell'organismo ospitante, cioè non cross-talk con le coppie endogene. La tecnica è affermata sia in procarioti ed eucarioti padroni di casa e cellule facilmente applicabile ai mammiferi. Coppie per l'incorporazione di ncAA in cellule di mammifero si basano su tre principali sistemi ortogonali: il sistema di tyrosyl, che combina il TyrRS da e. coli26 con un soppressore di tyrosyl ambra da b. stearothermophilus27 (CE TyrRS / coppia YamBst), l'e. coli leucyl sistema (CELeuRS/tRNALeuCUA coppia)6,18,28 e il sistema di pyrrolysyl degli Archaea (PylRS/tRNA PYL coppia)3, per cui il tRNAPyl è un soppressore di ambra naturale. In generale, ogni ncAA è riconosciuto da un ncAARS specializzato. A seconda della struttura della ncAA, la ncAARS è ottenuta tramite diretta evoluzione di TyrRS, LeuRS o PylRS, anche se alcune sintetasi possono accettare più di un ncAA.
La coppia ortogonale viene importata nelle celle utilizzando semplicemente un vettore plasmidico. Plasmidi più comune ed efficiente sono sialophosphoprotein e codificano sia per la sintetasi e il tRNA che formano la coppia ortogonale29. Un secondo plasmide che codifica per la proteina di interesse tenendo un codone ambrato presso il sito designato per la modifica è co-trasfettata. La ncAA è semplicemente aggiunta al medium della crescita cellulare. Tuttavia, diversi gruppi specializzati usano spesso diverse varianti del plasmide costrutti anche per l'incorporazione della stessa ncAA. Costrutti differiscono nella disposizione dei geni in vettoriale, tipo della sintetasi, l'utilizzo di codone nel gene sintetasi, l'utilizzo del promotore, variante del tRNA e il numero di cassette di espressione di tRNA. Inoltre, l'efficienza di incorporazione di ncAAs differenti possa variare drasticamente a causa la diversa efficienza catalitica della sintetasi diversi, la qualità del tRNA e altri fattori30. Pertanto, è importante avere a portata di mano un metodo veloce e affidabile per valutare l'efficienza di una coppia ortogonale, di scegliere il sistema più adatto per un'applicazione desiderata sia per eseguire alcune operazioni di ottimizzazione che migliorare la complessiva espressione della proteina rendimenti.
Abbiamo stabilito un'analisi semplice e robusta fluorescenza-basata per valutare l'efficienza di coppie ortogonali29 (Figura 1). Nell'analisi, le cellule vengono co-trasfettate con il plasmide che codifica per la coppia ortogonale, insieme con un plasmide del reporter sialophosphoprotein codifica per la proteina fluorescente verde recante un codone di stop ambra in una posizione permissiva (EGFPTAG) e il mCherry gene. Fluorescenza rossa e verde di lisati di cellule intere vengono lette in canali separati su un lettore di piastra in una piastra a 96 pozzetti. L'intensità della fluorescenza verde direttamente correla con l'efficienza di ambra soppressione, considerando che l'intensità di fluorescenza rossa dà una stima diretta delle dimensioni del campione misurato e l'efficienza di trasfezione. Rispetto a simili saggi basati sulla fluorescenza assistita cella ordinamento (FACS) leggere31,32, il test fornisce una valutazione immediata e approfondita dell'espressione della proteina nella popolazione intera cellula, che è più rappresentativo delle usuali condizioni sperimentali e offre una più facile acquisizione ed elaborazione dati con software standard. Nel complesso, il vantaggio principale dell'analisi è che un mezzo per un gran numero di campioni possa essere analizzato in parallelo. Usando questa analisi, abbiamo selezionato una libreria razionalmente progettata del soppressore-tRNAs per migliorare l'efficienza del sistema ortogonale Pyl30. Quest'opera descrive il protocollo sperimentale per eseguire questo test e mostrare esempi della sua applicazione, tra cui l'ottimizzazione della coppia ortogonale per l'incorporazione della foto-reticolazione ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e il confronto delle efficienze di incorporazione degli aminoacidi diversi (Figura 2).
Negli ultimi anni, strumenti ncAA si sono dimostrati molto potente per studiare strutturali e gli aspetti funzionali di proteine G accoppiate recettori (GPCR)33,34,35,36,37 , 38. in esseri umani, GPCR formano una grande famiglia di recettori di membrana (800 membri) e rappresentano i principali bersagli per farmaci terapeutici. Caratterizzazione strutturale diretto dei GPCR è comunque impegnativo e complementari metodi biochimici altamente sono necessari per le indagini. Abbiamo sperimentato l'uso di foto-reticolazione ncAAs per mappare le superfici GPCR e scoprire ligand binding tasche34. Utilizzando il nostro sistema ottimizzato per l'incorporazione di Azi, abbiamo incorporato sistematicamente Azi in tutto il dominio di juxtamembrane tutta di un GPCR direttamente in streaming in cellule di mammifero. All'irradiazione UV, Azi forma una specie di nitrene altamente reattivo che cattura covalentemente molecole vicine. Quando il ligando viene aggiunto al sistema, Azi funge da una sonda di prossimità per rivelare quali posizioni del recettore si avvicina il ligando associato. In questo modo, la modalità di associazione dell'ormone neuropeptide urocortina (Ucn1) sul ricevitore di classe B GPCR corticotropin-releasing-factor tipo 1 (CRF1R)33 in primo luogo è stata presentata. Ultimamente, abbiamo divulgato modelli distinti associazione di agonisti ed antagonisti sullo stesso recettore38. Un approccio simile è stato applicato da altri per rivelare ortosterici e siti di legame allosterico di altri peptidi e ligandi di piccola molecola altri GPCR39,40,41,42. Questo manoscritto descrive il protocollo sperimentale applicato nel nostro laboratorio per foto-reticolazione mappatura delle superfici GPCR. Il metodo è relativamente veloce, semplice e non richiede particolari attrezzature, cosicché è applicabile nei laboratori di biochimica standard. D'importanza, l'approccio fornisce un valido strumento non solo di identificare siti di legame del ligando dove scarseggiano i dati strutturali 3D, ma anche per integrare i dati esistenti in vitro con informazioni da recettori completamente traduzionalmente modificati nella ambiente fisiologico della cellula dal vivo.
Il recente sviluppo del romanzo ncAAs cuscinetto sul lato catena gruppi chimici adatti per ultraveloce privo di catalizzatore bioorthogonal chimica ha aperto la possibilità di installare fluorofori di ultima generazione per l'imaging di Super-risoluzione nelle proteine direttamente su live cellule2,43. Tali ancoranti chimici includono sforzata cyclooctyne SCOK14, biciclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17e trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 tra altri ncAAs che harboring un norbornene16,17,44 o Ciclopropene45,46 frazione. Ingombranti ncAAs per la bioorthogonal chimica sono incorporati da una variante di PylRS solitamente indicato come PylRSAF (che indica la mutazione Y271A e Y349F in M. barkeri PylRS), così come da altri ad hoc si è evoluto ncAARSs17 , 44. le ancore bioorthogonal reagiscono con tetrazine reagenti47 via cicloaddizione di Diels-Alder inversa elettrone-domanda di dare rendimenti elevati d'etichettatura entro pochi minuti43,48. Tuttavia, applicazione di questo approccio potente etichetta GPCR è stato impegnativo a causa di una bassa efficienza complessiva del sistema ortogonale di incorporazione ncAA. Utilizzando il nostro avanzato sistema di Pyl, recentemente abbiamo dimostrato ad alto rendimento incorporazione di tali aminoacidi GPCR e ultraveloce GPCR etichettatura sulla superficie delle cellule di mammiferi dal vivo30. Ricevitori con etichettati erano ancora funzionali, come hanno interiorizzato fisiologicamente attivando il recettore con un agonista. Il protocollo sperimentale per l'incorporazione di bioorthogonal ancore in GPCR e le seguenti operazioni di etichettatura sono descritti qui. Dotare i GPCR con fluorofori luminoso piccolo è il primo passo fondamentale verso lo studio delle dinamiche strutturali GPCR nella cella dal vivo tramite tecniche di microscopia avanzata.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

La genetica incorporazione di aminoacidi non canonico (ncAAs) via soppressione di codone di arresto ambra è una tecnica potente per installare sonde spaziali e reattiva moiety su proteine direttamente nella cella dal vivo. Ogni ncAA è incorporato da una dedicato coppia ortogonale soppressore-/ amino-acil-tRNA-sintetasi del tRNA (AARS) che viene importata nell'organismo ospite. L'efficienza di incorporazione di ncAAs differenti possa notevolmente differiscono ed essere insoddisfacente in alcuni casi. Coppie ortogonali possono essere migliorate modificando le RAA o il tRNA. Tuttavia, la diretta evoluzione del tRNA o AARS utilizzando librerie di grandi dimensioni e metodi di selezione morti/vivi non sono fattibili in cellule di mammifero. Qui, è presentata un'analisi di fluorescenza-basata facile e robusta per valutare l'efficienza di coppie ortogonali in cellule di mammifero. Il dosaggio permette lo screening di decine o centinaia di varianti AARS/tRNA con uno sforzo moderato ed entro un termine ragionevole. Uso di questo test per generare nuove tRNAs che migliorano significativamente l'efficienza del sistema ortogonale Pirrolisina è descritto, insieme all'applicazione di ncAAs allo studio di proteine G accoppiate recettori (GPCR), che rappresentano una sfida oggetti per ncAA mutagenesi. In primo luogo, incorporando sistematicamente un foto-reticolazione ncAA su tutta la superficie extracellulare di un recettore, siti di legame di diversi ligandi del recettore intatto vengono mappati direttamente nella cella dal vivo. Secondo, incorporando ncAAs di ultima generazione in un GPCR, recettore privo di catalizzatore ultraveloce etichettatura con un colorante fluorescente è dimostrato, che sfrutta bioorthogonal ceppo-promosso inversa Diels Alder cicloaddizione (SPIEDAC) su cellule vive. Come ncAAs può essere generalmente applicato a qualsiasi proteina indipendentemente dalla sua dimensione, il metodo è di interesse generale per un numero di applicazioni. Inoltre, incorporazione di ncAA non richiede particolari attrezzature e viene facilmente eseguita nei laboratori di biochimica standard.

Il contorno del dosaggio di fluorescenza è raffigurato nella Figura 1. Il dosaggio è impiegato in tre applicazioni. In primo luogo, un numero di varianti di tRNA per l'incorporazione di Lys(Boc) dalla coppia ortogonale Pyl vengono proiettato. Lys(BOC) è un amminoacido stericamente simile a Pyl. Come Pyl non è commercialmente disponibile, Lys(Boc) è comunemente usato come substrato standard per la PylRS. I tRNAs schermato si basano sul tRNAPyl....

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Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

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