Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

この作品は CO822/2-1 (Emmy Noether プログラム) と CO822/3-1 陽性の補助金の下で、ドイツ研究振興協会 (DFG) によって設立されました。

1. 結合効率 (図 1) の蛍光ベースのスクリーニング
<ol><li>ダルベッコ変更イーグル培地で HEK293 細胞を維持 (DMEM; 高グルコース、4 mM グルタミン、ピルビン酸) 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストレプトマイシンと補われます。</li>
	<li>種細胞のトランスフェクション前日。<ol>
<li>0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリ?...

プロトコルでは、直交ペアの ncAAs の哺乳類細胞で発現したタンパク質混入の効率を評価するためにシンプルで信頼性の高いアッセイについて説明します。FACS に基づいて広く使用されているアッセイを尊重しこの方法の主な利点は同時準備と多数のサンプルの測定を可能にしては簡単に普通のソフトウェアを使用して分析データを提供します。哺乳類細胞における直交ペアを分析する媒体ス?...

タンパク質化学プローブの遺伝的定款は、構造および動的な生細胞のネイティブ コンテキストに直接蛋白質機能の調査を促進する強力な手法です。今日では、非正規のアミノ酸 (ncAAs) 装備されて最も異なる化学グループの何百もの生合成1,2,3,4site-specifically タンパク質に組み込むことが。それらの間の 1 つを見つける写真されております5、写真ケージ6,7,8,9写真切替可能なアミノ酸10,などの感光性 ncAAs11, アミノ酸ベアリング緊張したアルケンとアルキン触媒無料 bioorthogonal 化学2,12,13,14,15,16 ,17, ダンシル18クマリン9,19, とプロダン20,21 fluorophores が付いて、運ぶアミノ酸およびアミノ酸として他の生物物理学的プローブを装備ポスト翻訳の修正1,2,3,4,22,23,24,25とも。
NcAA の遺伝のエンコーディングは、専用アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS)、同種サプレッサー tRNA、通常リボソーム合成の際に黄色停止コドンに対応 ncAA を取り入れたペアで有効です。ncAARS/tRNA のペアは、ホストの有機体すなわち内因性のペアしないクロストークで直交になるように設計されています。技術は、原核生物と真核生物のホストと哺乳類に簡単に該当するセルの両方確立しました。哺乳類細胞における定款の ncAA のペアは 3 つの主要な直交システムに基づいています: B. 中等度好熱27 (Ec からチロシン琥珀サプレッサーによるエシェリヒア属大腸菌の26から TyrRS を組み合わせたチロシル システムTyrRS/Bst山芋ペア)、エシェリヒア属大腸菌ロイシル システム (EcLeuRS/tRNAルーCUAペア)6,18,28および古細菌由来ピロリジル システム (PylRS/tRNAPylペア)3、tRNApyl ブランドがあるという自然な琥珀色の抑制。一般に、各 ncAA は特殊な ncAARS によって認識されます。NcAA の構造に応じて、ncAARS は、いくつかの合成は、複数の ncAA を受け入れることができますがの TyrRS LeuRS や PylRS、進化を介して取得されます。
直交のペアは、単にプラスミッドのベクトルを使用して、セルにインポートされます。最も一般的かつ効率的なプラスミドは bicistronic であり、合成酵素と直交ペア29を形成する tRNA の両方をエンコードします。変更用に指定されたサイトで琥珀のコドンを軸受興味の蛋白質のための第 2 プラスミド エンコーディングは cotransfected です。NcAA は細胞成長培地に単に追加されます。ただし、異なる専門のグループはしばしば同じ ncAA の体用もプラスミドの構造のさまざまなバリエーションを使用します。ベクトル合成酵素の種類、コドン使用合成酵素遺伝子、プロモーターの使い方、tRNA と tRNA 式カセット数のバリアントの遺伝子配列で構造が異なります。さらに、異なる ncAAs の取り込み効率は、異なるシンテターゼ、品質、tRNA および他の要因の30の異なる触媒効率のため大幅に変更できます。したがって、それは手で直交ペア、全体的な蛋白質の表現を向上させるいくつかの最適化のステップを実行して、目的のアプリケーションに最も適したシステムを選択する両方の効率を評価する高速で信頼性の高いメソッドを持つことが重要得られます。
直交ペア29 (図 1) の効率を評価するためのシンプルで堅牢な蛍光ベースのアッセイを設けています。アッセイ、細胞が一緒にレポーターの bicistronic プラスミド寛容な位置 (EGFPタグ) 黄色停止コドンを軸受緑色蛍光タンパク質の両方をエンコードの直交ペアのプラスミッドのエンコーディングで cotransfected とmCherry 遺伝子。全体セル lysates の赤と緑の蛍光プレート リーダー、96 ウェル プレートでの独立したチャンネルで読み取られます。赤い蛍光性の強度は、測定サンプルとトランスフェクション効率のサイズの直接推定値を与えるに対し、緑の蛍光性の強度は直接琥珀色の抑制の効率と相関します。蛍光に基づいて同様の試金に関してアシスト セル (FACS) を並べ替え読み上げる31,32アッセイは、詳細セル全体の人口でタンパク質発現の包括的な評価を与える通常の実験条件の代表的な容易なデータ取得と標準ソフトウェアによる処理を提供しています。全体的に、アッセイの主な利点は、サンプル数が多いために、媒体は並行して分析できます。この試金を使用して、Pyl 直交系30の効率を向上させるサプレッサー Trna の合理的に設計されたライブラリを上映しました。この作品は、この分析を実行し、光橋 ncAA p アジドフェニル-L-フェニルアラニン (ウェット) 定款の直交ペアの最適化との比較など、応用事例を示す実験的プロトコルをについて説明します種類のアミノ酸 (図 2) の取り込み効率。
最後の年に ncAA のツールは非常に強力な構造を調査する実証されているし、G タンパク質の機能的な側面結合受容体 (Gpcr)33,34,35,36,37,38. ヒトでは、Gpcr 膜受容体 (800 人) の大家族を形成し、治療薬の主なターゲットを表しています。Gpcr の直接構造解析まだやりがいや補完的な生化学的手法が非常に彼らの調査のため必要があります。我々 が GPCR にサーフェスをマップし、リガンド結合ポケット34を発見光橋 ncAAs の使用の先駆者します。シュワンツの混入のための最適なシステムを使用して、我々 は体系的に生きている哺乳類セルに直接 GPCR の全体細胞ドメイン全体シュワンツを設立しました。UV 照射、シュワンツは近隣の分子が共有結合キャプチャ ナイトレンと反応性の高い種を形成します。リガンドをシステムに追加すると、シュワンツは受容体の位置に近づくバインドされたリガンドを明らかにするための近接プローブとして機能します。このように、神経ペプチド ホルモン私 (Ucn1) クラス B GPCR 副腎皮質刺激ホルモン-放出-因子受容体のタイプ 1 (CRF1R)33 Urocortin のバインディング モード初披露。最近、アゴニスト及びアンタゴニストの同じ受容体38の異なるバインドのパターンを開示しました。同様のアプローチは、orthosteric と他のペプチドや他の Gpcr の39,の40,41,の42の小分子リガンドのアロステリック結合部位を明らかにする他のユーザーによって適用されています。本稿では、光橋 GPCR 表面のマッピングの研究室において実験的プロトコルについて説明します。メソッドは、比較的高速な簡単なと標準生化学演習で適用されるように特別な装置を必要としません。重要なは、立体構造データが不足しており、リガンド結合部位を特定するだけでなく、またファーストクリーニング完全に変更された受容器からの情報を既存の in vitroデータを補完する貴重なツールを提供するアプローチ、生細胞の生理学的な環境。
新規の ncAAs 側鎖化学グループ超高速触媒無料 bioorthogonal 化学に適した軸受の最近の開発は蛋白質に超解像イメージングの最後の世代の蛍光物質をインストールする可能性を開いたライブで直接細胞の2,43を実行します。このようなケミカル アンカーは、緊張した cyclooctyne SCOK14BCNK12,17ビシクロ [6.1.0] nonyne と TCO のトランス cyclooctenes * K13,15,17他の ncAAs の間でノルボルネン16,17,44またはシクロプロペン45,46基をかくまっています。かさばる ncAAs bioorthogonal 化学 PylRSAFとして通常示される PylRS の変形によって組み込まれている (突然変異を示す Y271A、 M. barkeriの PylRS の Y349F)、その他アドホック進化 ncAARSs17よると同様,44. bioorthogonal アンカーがいくつ分43,48ラベリング高利回りを与える逆電子需要ディールス ・ アルダー付加環化反応による tetrazine 試薬47と反応します。ただし、直交の ncAA 設立システムの全体的な効率が低いため Gpcr のラベルにこの強力なアプローチの応用にチャレンジしております。私たちの強化された Pyl のシステムを使用して、我々 は最近 Gpcr と超高速 GPCR は、生きている哺乳類セル30の表面上のラベルにこのようなアミノ酸の高収率定款を実証しました。ラベル付けされた受容体の通り彼らは生理学的アゴニストの受容体を活性化時に内面のまだ機能している。Bioorthogonal 定款の実験的プロトコルが Gpcr に固定し、ラベリング手順をここで説明します。小さな明るい fluorophores が付いている Gpcr で装備は、高度な顕微鏡技術を介して生きているセルの GPCR の構造ダイナミクスの研究に向けた最初の基本的なステップです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

遺伝的非正規アミノ酸 (ncAAs) 黄色停止コドン抑制を介して定款は、生細胞に直接人工プローブと反応性タンパク質をインストールするのには強力な手法です。各 ncAA はホストの有機体にインポートされる専用直交サプレッサー tRNA/アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS) ペアが組み込まれます。異なる ncAAs の取り込み効率大幅異なるできいくつかのケースで満足できます。直交ペアは AARS または tRNA のいずれかを操作することによって改善できます。ただし、tRNA や AARS の大規模なライブラリと死者/生きている選択方法を使用しての進化には哺乳類細胞で、可能ではありません。ここでは、哺乳類細胞における直交ペアの効率を評価するための簡易で堅牢な蛍光ベースの分析が表示されます。アッセイは、AAR/tRNA バリエーションそれなりの努力と合理的な時間内の数百数十をスクリーニングできます。ピロリシン直交系の効率を大幅に向上させる新しい Trna を生成するこのアッセイの使用説明は、ncAAs の G タンパク質の研究への応用とともに結合受容体 (Gpcr)、ncAA のオブジェクト挑戦しています。突然変異誘発。最初に、体系的に組み込むことで受容体の細胞外表面部分を通して光橋 ncAA、そのまま受容体の異なる配位子の結合部位は生細胞に直接マップされます。第二に、GPCR に最後の世代の ncAAs を組み込むこと、超高速触媒無料受容体の蛍光色素をラベル付けを発揮、bioorthogonal ひずみ昇格逆ディールス ・ アルダー付加環化反応 (SPIEDAC) 生きている細胞を悪用します。NcAAs できます一般に適用するには、そのサイズに個別に蛋白質をメソッドが関心を持つアプリケーションの数です。また、ncAA 定款は特別な装置を必要としないし、標準生化学研究所で簡単に実行されます。

蛍光アッセイの概要は、図 1に描かれています。アッセイは、3 つのアプリケーションで採用されています。まず初めに、Pyl 直交ペアで Lys(Boc) の定款の tRNA の亜種の数は除かれます。Lys(Boc) は、アミノ酸立体 Pyl のようです。Pyl は市販、Lys(Boc)、PylRS の標準的な基板として使用されます。選別された Trna を tRNA に基づくpyl ブランド。そ?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr) を研究への応用を説明します。

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

有機マグネットの化学気相堆積、バナジウムテトラ

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

サーモ可逆架橋ゴム経由アルダー化学の合成と性質

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

の調製と評価<sup&gt; 99メートル</sup&gt; Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...