Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

이 작품에서 CO822/2-1 (에 미 뇌터 프로그램) 및 CO822/3-1 I.C. 보조금 도이치 가운데 (DFG)에 의해 설립 되었습니다.

1. 형광 기반 심사 관 효율성 (그림 1)의
<ol><li>Dulbecco의 수정이 글의 중간에 HEK293 세포 유지 (DMEM; 높은 포도 당, 4mm 글루타민, pyruvate) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린, 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 100 µ g/mL 스 보완.</li>
	<li>씨 셀 transfection 전날입니다.<ol>
<li>트립 신/PBS 0.5 m EDTA 보충 0.05%에서 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 분리 합니다. 1 mL 트립 신/EDTA를 ?...

프로토콜에는 포유류 세포에 표현 된 단백질으로 ncAAs의 설립에 대 한 직교 쌍의 효율성을 평가 하기 위해 간단 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과를 설명 합니다. FACS에 따라 널리 사용 되는 분석 실험에이 방법의 주요 장점은 동시 준비 및 샘플의 더 많은 수의 측정을 쉽게 일반 소프트웨어를 사용 하 여 분석 데이터를 제공 합니다. 포유류 세포에서 직교 쌍을 분석 하는 중간 처리 방법의 가용성은 ?...

단백질으로 화학 감지기의 유전 결합 구조와 동적 라이브 셀의 네이티브 컨텍스트에서 직접 단백질 기능 측면의 조사를 용이 하 게 하는 강력한 방법입니다. 요즘, 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs) 가장 이질적인 화학 그룹으로 갖춰진 수백 수 있습니다 site-specifically 통합 단백질 생 합성1,2,,34. 서로 한 crosslinkers 사진5, 사진 갇힌6,7,,89 사진 전환 아미노산10, 등 사진에 민감한 ncAAs 발견 11, 아미노산 베어링 긴장 된 알 켄 및 촉매 무료 bioorthogonal 화학2,12,13,14,15,16 alkynes ,17, dansyl18,19coumarin9,및 prodan20,21 fluorophores, 운반 하는 아미노산 및 아미노산으로 다른 생물 프로브 장착 게시물 변환 수정1,2,3,4,22,23,,2425와 마찬가지로 잘.
유전자는 ncAA의 인코딩는 전용된 아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS)는 동족 억압-tRNA, 일반 ribosomal 합성 중 황색 정지 codon에 번의 전미 대학 통합을 쌍으로 사용 됩니다. ncAARS/tRNA 쌍 호스트 유기 체, 즉 생 쌍 하지 잡담에에서 직교 수 있도록 설계 됩니다. 기술은 간결한 및 진 핵 호스트와 쉽게 적용 포유류 세포에서 잘 설립 이다. 포유류 세포에 있는 번의 전미 대학 설립에 대 한 쌍은 세 가지 주요 직교 시스템에 기반으로: B. stearothermophilus27 (Ec tyrosyl 호박 억압 대장균26 에서 TyrRS를 결합 하 여 tyrosyl 시스템 TyrRS /Bst참 마 쌍), 대장균 leucyl 시스템 (Ec그들/tRNA레이CUA 쌍)6,,1828 그리고 archaeal pyrrolysyl 시스템 (PylRS/tRNA Pyl 쌍)3, 그것에 의하여는 tRNAPyl 천연 호박 억압. 일반적으로, 각 ncAA 전문된 ncAARS에 의해 인식 된다. NcAA의 구조에 따라 일부 synthetases 이상의 ncAA를 받아들일 수 있지만 ncAARS TyrRS, 그들 또는 PylRS의 감독된 진화를 통해 얻어진 다.
직교 쌍 단순히 플라스 미드 벡터를 사용 하 여 셀에 가져오기 됩니다. 가장 일반적이 고 효율적인 플라스 미드는 bicistronic 하 고 모두는 합성 및 직교 쌍29를 형성 하는 tRNA를 인코딩합니다. 두 번째 플라스 미드 인코딩 수정에 대 한 지정 사이트에는 호박 codon 베어링 관심사의 단백질에 대 한 공동 transfected 이다. NcAA는 단순히 셀 성장 매체에 추가 됩니다. 그러나, 다른 전문된 그룹 종종 같은 ncAA의 설립에도 플라스 미드 구조물의 다른 이체를 사용합니다. 구문을 벡터은 합성 유형의 합성 유전자, 발기인 사용, tRNA와 tRNA 식 카세트의 수의 변종에 codon 사용법에 유전자의 배열에서 다르다. 또한, 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다른 synthetases, tRNA, 및 다른 요인30의 품질의 다른 촉매 효율성으로 인해 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 손에 원하는 응용 프로그램에 대 한 가장 적합 한 시스템을 선택 하 고 전체 단백질 식이 개선 하는 몇 가지 최적화 단계를 수행 하는 직교 쌍의 효율성을 평가 하는 신속 하 고 안정적인 방법을 갖는 것이 중요 생성합니다.
우리는 간단 하 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍29 (그림 1)의 효율성을 평가 하기 위해 설립. 분석 결과, 세포는 플라스 미드 인코딩을 모두 허용 위치 (EGFP태그)에 황색 정지 codon를 베어링 녹색 형광 단백질에 대 한 인코딩 bicistronic 기자 플라스 미드와 직교 쌍에 대 한 공동 transfected와 mCherry 유전자입니다. 전체 세포 lysates의 빨강과 녹색 형광 96 잘 접시에서 플레이트 리더에 별도 채널에서 읽혀집니다. 빨간 형광의 강도 측정된 샘플 크기 transfection 효율의 직접적인 견적 제공 하는 반면 녹색 형광의 강도 직접 호박 억제의 효율성과 상관 한다. 형광에 따라 유사한 분석 실험에 관하여 보조 셀 정렬 (FACS) 읽기31,32, 밖으로 더 전체 세포 인구에 단백질 식의 즉각적이 고 포괄적인 평가 제공 하는 분석 결과 일반적인 실험 조건의 대표는 쉽게 데이터 수집 및 처리 표준 소프트웨어를 제공 합니다. 전반적으로, 분석 결과의 주요 장점은 샘플의 다 수 매체 동시에 분석할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 억압-tRNAs Pyl 직교 시스템30의 효율성을 개선 하기 위해 합리적으로 설계 된 도서관을 상영 했습니다. 이 작업 수행이 분석 결과 사진-가교 ncAA p-azido-L-페닐알라닌 (매)의 설립에 대 한 직교 쌍의 최적화와의 비교를 포함 하 여 그 응용 프로그램의 예를 보여을 실험 프로토콜을 설명 합니다. 다른 아미노산 (그림 2)의 법인 효율성
지난 년 동안 ncAA 도구 구조를 조사 하기 위해 매우 강력한 입증 된 및 기능적 측면의 G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs)33,34,35,,3637 , 38. 인간, GPCRs 막 수용 체 (800 명)의 대 가족을 형성 하 고 치료 약물에 대 한 주요 목표를 나타냅니다. GPCRs의 직접 구조 특성 아직도 도전 이며 보완적인 생 화 확 적인 방법 그들의 조사에 필요한 높은. 우리 사진 가교 ncAAs GPCR 표면 지도 ligand 바인딩 주머니34를 발견 하 고의 사용을 개척 했습니다. 체계적으로 라이브 포유류 세포에서 직접 GPCR의 전체 juxtamembrane 도메인에 걸쳐 매를 통합 매 관에 대 한 최적화 된 시스템을 사용 하 여, 우리. UV 조사에 따라 매를 covalently 이웃 분자 반응성이 매우 높은 nitrene 종 형성. 리간드를 시스템에 추가 될 때 매 근접 프로브는 수용 체의 위치는 바인딩된 ligand 가까이 서 공개를 제공 합니다. 이 방법에서는, Urocortin (Ucn1) 클래스 B GPCR corticotropin 풀어-팩터 수용 체에 입력 1 (CRF1R)33 neuropeptide 호르몬의 바인딩 모드 처음 공개 됐다. 최근에, 우리는 촉진제와38동일한 수용 체 길 항 근의 고유한 바인딩 패턴 공개는. 유사한 접근은 orthosteric와 다른 펩 티 드 및 다른 GPCRs39,40,,4142에 작은 분자 ligands의 allosteric 바인딩 사이트에 다른 사람에 의해 적용 되었다. 이 원고는 GPCR 표면 사진 가교 매핑에 대 한 우리의 실험실에서 적용 실험 프로토콜을 설명 합니다. 메서드는 비교적 빠르고, 간단 하 고 표준 생화학 실험실에 적용 되도록 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다. 중요 한 것은, 접근 제공 뿐만 아니라 ligand 바인딩 사이트 3D 구조 데이터 부족, 식별 뿐만 아니라 기존의 체 외에 데이터에 post-translationally 완전히 수정 된 수용 체에서 정보를 보완 하기 위해 유용한 도구는 살아있는 세포의 생리 적인 환경입니다.
소설 ncAAs 측면 체인 화학 그룹 초고속 촉매 무료 bioorthogonal 화학에 대 한 적합 한 베어링의 최근 개발은 단백질으로 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 마지막 세대 fluorophores 설치 가능성 열었다 라이브에 직접2,43세포. 이러한 화학 앵커 포함 긴장된 cyclooctyne SCOK14, BCNK12,17, bicyclo [6.1.0] nonyne 및 TCO에 트랜스-cyclooctenes * 다른 ncAAs 중 K13,,1517 norbornene16,17,44 또는 cyclopropene45,46 moiety 은닉. 일반적으로 PylRSAF 로 표시 하는 PylRS의 변형에 의해 부피가 ncAAs bioorthogonal 화학에 대 한 통합 (돌연변이 나타내는 Y271A와 Y349F M. barkeri PylRS에), 뿐만 아니라 다른 임시 진화 ncAARSs17 에 의해 , 44. bioorthogonal 앵커 tetrazine 시 약47 역 전자-수요 Diels 오리 나무 cycloaddition 몇 분43,48내 높은 라벨 수익률을 제공을 통해 반응. 그러나, 레이블을 GPCRs이 강력한 방법의 응용 프로그램 직교 ncAA 법인 시스템의 낮은 전반적인 효율성 때문 도전 하고있다. 우리의 향상 된 Pyl 시스템을 사용 하 여, 우리 최근 GPCRs 및 초고속 GPCR30라이브 포유류 세포 표면에 라벨에 같은 아미노산의 높은 수율 설립을 증명 하고있다. 레이블이 지정 된 수용 체 그들은 생리 적으로 길 항 제와 수용 체 활성화에 따라 내 면 여전히 작동 했다. Bioorthogonal의 설립에 대 한 실험 프로토콜 GPCRs로 고정 하 고 라벨 다음과 설명. 작은 밝은 fluorophores GPCRs 장비 고급 현미경 기술을 통해 라이브 셀에서 GPCR 구조 역학의 연구 향한 첫 기본 단계입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

호박 정지 codon 억제를 통해 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs)의 유전 결합 인공 프로브 및 단백질에 반응 moieties 라이브 셀에 직접 설치 하는 강력한 기술입니다. 각 ncAA 호스트 유기 체로 가져온 전용된 직교 억압-tRNA/아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS) 쌍으로 통합 됩니다. 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다, 하 고 어떤 경우에 만족 될 수 있습니다. 직교 쌍은 AARS 또는 tRNA를 조작 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 그러나, tRNA 또는 AARS 큰 라이브러리를 사용 하 여 죽은/살아 선택 방법의 감독된 진화 되지 않습니다 가능한 포유류 세포에서. 여기, 손쉬운 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍 포유류 세포에서의 효율성을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 분석 결과 적당 한 노력으로 적절 한 시간 내 AARS/tRNA 변종의 수백 수만 심사 가능 Pyrrolysine 직교 시스템의 효율성을 크게 향상 시킬 새로운 tRNAs 생성 하는이 분석 결과의 사용 설명, G-단백질의 연구 ncAAs의 응용 프로그램과 함께 결합 수용 체 (GPCRs), 미식 축구에 대 한 개체에 도전 mutagenesis입니다. 첫째, 통합 하 여 체계적으로 수용 체의 세포 외 표면에 걸쳐 사진 가교 ncAA, 그대로 수용 체에 다른 ligands의 바인딩 사이트는 라이브 셀에 직접 매핑됩니다. 둘째는 GPCR에 마지막 세대 ncAAs를 통합 하 여 초고속 촉매 무료 수용 체는 형광 염료와 라벨 시연 되는 bioorthogonal 스트레인 승진 역 Diels 오리 나무 cycloaddition (SPIEDAC) 라이브 셀에 악용. NcAAs 크기에 독립적으로 어떤 단백질에 일반적으로 적용할 수 있는로 방법은 응용 프로그램의 수에 대 한 일반적인 관심의 이다. 또한, 번의 전미 대학 설립 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 쉽게 표준 생화학 실험실에서 수행 됩니다.

형광 분석 결과의 개요는 그림 1에 묘사 된다. 분석 결과 세 가지 응용 프로그램에서 채택 된다. 첫 번째 장소에서 tRNA 변종 Pyl 직교 쌍에 의해 Lys(Boc)의 설립에 대 한 수는 상영 된다. Lys(Boc)은 sterically Pyl 유사 아미노산. Pyl 상용으로, Lys(Boc)는 일반적으로 PylRS에 대 한 표준 기판으로 사용. tRNA를 기반으로하는 스크린된 tRNAsPyl. 각 tRNA 변형을 단?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

연구

화학

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

자석의 유기 화학 기상 증착, 바나듐 테트라시

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

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This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

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The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

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준비 및 평가<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal 화학을 사용하여 사전이 타겟팅에 대한 세자리 킬레이트를 Tc를 표지

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...