Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Dette arbeidet er grunnlagt av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under tilskudd CO822/2-1 (Emmy-Noether program) og CO822/3-1 til IC

1. fluorescens-basert Screening av inkorporering effektivitet (figur 1)
<ol><li>Opprettholde HEK293 celler i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM; høy glukose, 4 mM glutamin, pyruvate) med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO2.</li>
	<li>Frø cellene dagen før transfection.<ol>
<li>Koble celler for 5 min på 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS supplert med 0,5 mM EDTA. Bruk 1 mL Trypsin/EDTA for en 10 cm...

Protokollen beskriver en enkel og pålitelig analysen for å vurdere effektiviteten av ortogonale for inkorporering av ncAAs proteiner i pattedyrceller. Den største fordelen med denne metoden gjelder brukte analyser basert på FACS er at det tillater samtidig forberedelse og måling av større antall prøver, og gir data som analyseres enkelt ved hjelp av en vanlig programvare. Tilgjengeligheten av en medium gjennomstrømming metode for å analysere ortogonale par i pattedyrceller er svært viktig for utviklingen av nye...

Genetisk inkorporering av kjemiske sonder i proteiner er en kraftig metode å lette etterforskningen av strukturelle og dynamisk aspekter av protein funksjonen direkte i opprinnelige kontekst av levende celle. I dag, kan hundrevis av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) utstyrt med de mest ulike kjemiske gruppene site-specifically innlemmet i proteiner av biosyntesen1,2,3,4. Mellom dem, finner man Foto-sensitive ncAAs som Foto-crosslinkers5, foto-bur6,7,8,9 og foto-valgbar aminosyrer10, 11, aminosyrer anstrengt alkener og alkynes for katalysator-fri bioorthogonal kjemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyrer bærer dansyl18, kumarin9,19og prodan20,21 fluorophores og aminosyrer utstyrt med andre Biofysiske sonder som godt som med innlegg translasjonsforskning modifikasjoner1,2,3,4,22,23,24,25.
Genetiske kodingen av en ncAA aktiveres som en dedikert amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) koblet til en beslektet suppressor-tRNA, som inkorporerer ncAA svar på en gul stopp codon under vanlige ribosomal syntese. ncAARS/tRNA par er konstruert for å være ortogonale i verten organisme, altså ikke cross-talk med endogene parene. Teknikken er godt etablert både i prokaryotic og eukaryotic verter og lett gjelder pattedyr celler. Par for ncAA innlemmelse i pattedyrceller er basert på tre viktigste ortogonale systemer: tyrosyl systemet, som kombinerer TyrRS E. coli26 med en tyrosyl rav suppressor fra B. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstYam par), E. coli leucyl system (EcLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 og archaeal pyrrolysyl system (PylRS-tRNA- Pyl par)3, der tRNAPyl er en naturlig rav suppressor. Generelt, gjenkjennes hver ncAA av en spesialisert ncAARS. Avhengig av ncAA struktur, er ncAARS innhentet via regissert utviklingen av TyrRS, LeuRS eller PylRS, selv om noen synthetases kan godta flere ncAA.
Ortogonale paret importeres inn i cellene ved å bruke en plasmider vektor. Mest vanlige og effektive plasmider er bicistronic og kode både i synthetase og tRNA danner ortogonale par29. En andre plasmider koding for protein av rentebærende et gult codon på stedet angitt for endring er co transfekterte. NcAA legges bare til celle vekst medium. Imidlertid bruker forskjellige spesialiserte grupper ofte ulike varianter av plasmider konstruksjoner for inkorporering av samme ncAA. Konstruksjoner varierer i ordningen av gener i vektor, type av synthetase, codon bruk i synthetase genet, formidler bruk, variant av tRNA og antall tRNA uttrykk kassetter. Videre kan innlemmelse effektiviteten av forskjellige ncAAs variere drastisk på grunn av ulike katalytisk effektiviteten av de forskjellige synthetases, kvaliteten på tRNA og andre faktorer30. Derfor er det viktig å ha på hånden en rask og pålitelig metode for å vurdere effektiviteten av et ortogonale par, både å velge det mest passende systemet for et ønsket program og utføre noen optimering skritt som forbedrer generell protein uttrykk gir.
Vi har etablert en enkel og robust fluorescens-baserte analysen for å evaluere effektiviteten av ortogonale par29 (figur 1). I analysen, cellene er co transfekterte med plasmider koding for ortogonale paret, sammen med en bicistronic reporter plasmider koding både for grønne fluorescerende protein bærer en gul stopp codon på en ettergivende posisjon (EGFPTAG) og mCherry gene. Rød og grønn fluorescens av hele celler lysates leses i separate kanaler på en plate leser i en 96-brønns plate. Intensiteten av den grønne fluorescensen direkte korrelerer med effektiviteten av rav undertrykkelse, mens intensiteten av rød fluorescens gir en direkte anslag over størrelsen på målt prøven og transfection effektiviteten. Med hensyn til lignende analyser basert på fluorescens lese assistert celle sortering (FACS) ut31,32, analysen gir en umiddelbar og omfattende vurdering av protein uttrykk i befolkningen hele cellen, som er mer representant for vanlige eksperimentelle forhold, og tilbyr en enklere datainnsamling og prosessering programvare. Samlet er den største fordelen med analysen som et medium til et stort antall prøver kan bli analysert i parallell. Bruker denne analysen, har vi vist et rasjonelt utformet bibliotek med suppressor-tRNAs for å effektivisere Pyl ortogonale systemet30. Dette verket beskriver eksperimentelle protokollen for å utføre denne analysen og viser eksempler på programmet, inkludert optimalisering av ortogonale paret inkorporering av den Foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanin (Azi) og sammenligning av inkorporering effektiviteten av ulike aminosyrer (figur 2).
De siste årene, ncAA verktøy har vist seg svært kraftig undersøke strukturelle og funksjonelle aspekter av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs),33,,34,,35,,36,,37 , 38. hos mennesker, GPCRs danner en stor familie membran reseptorer (800 medlemmer) og representerer viktigste mål for terapeutisk narkotika. Direkte strukturelle karakterisering av GPCRs er fortsatt utfordrende og komplementære biokjemiske metoder er svært nødvendig for etterforskningen. Vi har banebrytende bruk av foto-crosslinking ncAAs kartet GPCR overflater og oppdage ligand binding lommer34. Bruker systemet vårt er optimalisert for Azi innlemmelse, innlemmet vi systematisk Azi gjennom hele juxtamembrane domenet for en GPCR direkte i live pattedyrceller. På UV bestråling danner Azi en svært reaktive nitrene arter som covalently fanger nærliggende molekyler. Når ligand legges til systemet, fungerer Azi som en nærhet sonde å avsløre posisjoner av reseptoren komme nær bundet ligand. På denne måten ble bindingsmodus av neuropeptide hormone Urocortin jeg (Ucn1) på klasse B GPCR corticotropin-slippe-faktor reseptoren type 1 (CRF1R)33 først lansert. I det siste har vi avslørte distinkte bindende bruksmønstre agonister og motstanderne på det samme reseptor38. En lignende tilnærming har blitt brukt av andre å avsløre orthosteric og allosteric bindende områder av andre peptider og små molekyl ligander på andre GPCRs39,40,41,42. Dette manuskriptet beskriver eksperimentelle protokollen anvendt i vår lab for foto-crosslinking tilordning av GPCR overflater. Metoden er relativt rask, enkel og krever ikke spesielt utstyr, slik at det er aktuelt i standard biokjemi laboratorier. Viktigere, tilnærmingen gir et verdifullt verktøy ikke bare å identifisere ligand binding områder der 3D strukturelle data er mangelvare, men også å komplettere eksisterende i vitro data med informasjon fra fullt post-translationally endret reseptorer i den fysiologiske miljø i live cellen.
Den siste utviklingen av romanen ncAAs betydning siden kjeden kjemiske gruppene egner for superrask katalysator-fri bioorthogonal kjemi har åpnet opp muligheten til å installere siste generasjons fluorophores for super-oppløsning bildebehandling i proteiner direkte på live celler2,43. Slike kjemiske ankere inneholde anstrengt cyclooctyne i SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, og trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 blant andre ncAAs skjuler en norbornene16,17,44 eller cyclopropene45,46 moiety. Store ncAAs i bioorthogonal kjemi er innlemmet ved en variant av PylRS vanligvis merket som PylRSAF (som angir mutasjon Y271A og Y349F i M. barkeri PylRS), så vel som av andre ad hoc utviklet ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankere reagere med tetrazine reagenser47 via omvendt elektron-demand Diels-or cycloaddition å gi høy merking avkastning innen et par minutter43,48. Men har anvendelsen av denne kraftige tilnærmingen til etiketten GPCRs vært utfordrende på grunn av en lav virkningsgraden i ortogonale ncAA innlemmelse systemet. Bruke vår forbedrede Pyl system, har vi nylig vist høy dekkevne innlemmelse av slike aminosyrer i GPCRs og lynraske GPCR merking på overflaten av live pattedyrceller30. Merket reseptorer var fremdeles funksjonell, som de fysiologisk internalisert på aktivere reseptoren med en Agonistiske. Eksperimentell protokollen for inkorporering av bioorthogonal plugger i GPCRs og merking følgende beskrives her. Utstyre GPCRs med små lyse fluorophores er det første grunnleggende skrittet mot studiet av GPCR strukturelle dynamikken i live cellen via avanserte mikroskopi teknikker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

Genetisk inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via rav stopp codon undertrykkelse er en kraftfull teknikk installere kunstige sonder og reaktive moieties på proteiner direkte i live cellen. Hver ncAA er innarbeidet med en dedikert ortogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) par som importeres inn i verten organisme. Inkorporering effektiviteten av forskjellige ncAAs varierer sterkt, og være tilfredsstillende i noen tilfeller. Ortogonale par kan forbedres ved å manipulere AARS eller i tRNA. Men regissert utviklingen av tRNA eller AARS store biblioteker og døde/levende utvalg metoder er ikke gjennomførbart i pattedyrceller. Her vises en lettvinte og robust fluorescens-baserte analysen å evaluere effektiviteten av ortogonale par i pattedyrceller. Analysen kan screening titalls til hundrevis av AARS/tRNA varianter med en moderat innsats og innen rimelig tid. Bruk av denne analysen til å generere nye tRNAs som forbedrer effektiviteten av pyrrolysine ortogonale betydelig er beskrevet, sammen med bruk av ncAAs til studiet av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs), som er utfordrende objekter for ncAA mutagenese. Først, ved å systematisk innlemme en foto-crosslinking ncAA gjennom ekstracellulære overflaten av en reseptor, bindende områder av forskjellige ligander på intakt reseptoren tilordnes direkte i live cellen. Andre, ved å innlemme siste generasjons ncAAs i en GPCR, lynraske katalysator-fri reseptor merking med et fluorescerende farge er bevist, som utnytter bioorthogonal belastning forfremmet omvendt Diels or cycloaddition (SPIEDAC) på den levende cellen. Som ncAAs kan generelt brukes til alle protein i størrelse, er metoden av generell interesse for en rekke applikasjoner. I tillegg ncAA innlemmelse krever ikke spesialutstyr og utføres enkelt i standard biokjemi laboratorier.

Omrisset av fluorescens analysen er avbildet i figur 1. Analysen er ansatt i tre programmer. I første omgang, er et antall tRNA varianter for innlemmelse av Lys(Boc) av Pyl ortogonale paret vist. Lys(Boc) er en aminosyre som er sterically lik Pyl. Som Pyl ikke er kommersielt tilgjengelig, brukes Lys(Boc) vanligvis som en standard substrat for PylRS. Vist tRNAs er basert på tRNAPyl. Hver tRNA variant bærer mutasjoner enkelt baser eller base-paren...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

En lettvinte fluorescens analysen er presentert for å evaluere effektiviteten av amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA omfatter ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i proteiner i pattedyrceller. Bruk av ncAAs å studere G-protein kombinert reseptorer (GPCRs) er beskrevet, inkludert Foto-crosslinking tilordning av bindende områder og bioorthogonal GPCR merking på levende celler.

Optimalisere genetisk inkorporering av kjemiske sonder i GPCRs for foto-crosslinking kartlegging og Bioorthogonal kjemi i Live pattedyrceller

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

En enkel og rask protokoll for måling av nøytrale lipider i algecellene med fluoresens

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Chemical Vapor Nedfall av en organisk Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av Plant Wall Heteroxylans Bruke enzymic, Chemical (Metylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Immobilisering av Multi-biocatalysts i alginatkuler for kofaktor Regeneration og forbedret Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

Fremstillingen og egenskapene av Thermo-reversibelt tverrbundet gummi Via Diels-Alder kjemi

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Innsikt i de Samhandling av aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Bruke Single-Molecule Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Utarbeidelse og evaluering av<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-merket tredentat Chelates for Pre-måls Bruke Bioorthogonal kjemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...