Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Эта работа была основана на Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) под гранты CO822/2-1 (Эмми Нётер программы) и CO822/3-1-I.C.

1. на основе флуоресценции скрининг эффективности включения (рис. 1)
<ol><li>Сохранить HEK293 клеток в среде Дульбекко изменение орла (DMEM; высокие глюкоза, 4 мм глутамина, пируват) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажно?...

Протокол описывает простой и надежный анализа для оценки эффективности ортогональных пар для включения ncAAs в белки, выраженные в mammalian клетках. Главное преимущество этого метода в отношении широко используемых анализов на основе СУИМ является, что она позволяет одновременной подготов...

Генетических включение химических зондов в белки это мощный метод для содействия расследованию структурных и динамических аспектов белков функции непосредственно в собственном контексте живой клетки. В настоящее время сотни неканонических аминокислот (ncAAs) оснащены наиболее разрозненные химических групп могут быть site-specifically включены в белки биосинтез1,2,3,4. Между ними, один находит Фото чувствительных ncAAs такие фото сшиватели5, Фото клетке6,,78,9 и фото переключаемый аминокислоты10, 11, аминокислоты, учитывая напряженные алкенов и алкинам бесплатно катализатор bioorthogonal химии2,12,13,14,15,16 ,17, аминокислоты, перевозящих Дансил18, кумарина9,19и21 флуорофоров продан20,и аминокислот с другими биофизических зонды как Ну как с поста поступательные изменения1,2,3,4,,2223,24,25.
Генетического кодирования ncAA включена на выделенный амино ацил тРНК синтетаза (ОРСЕ) паре родственных подавитель тРНК, который включает ncAA в ответ янтаря стоп-кодон во время регулярных рибосомных синтеза. ncAARS/tRNA пар спроектированы таким образом, чтобы быть ортогональные в организме хозяина, т.е. не кросс разговор с эндогенного парами. Методика является хорошо установленным в прокариот и эукариот хостов и легко применимые к mammalian клеток. Пар для включения ncAA в mammalian клетках основываются на трех основных систем ортогональных: тирозил системы, которая объединяет TyrRS E. coli26 с супрессор тирозил янтаря с б. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstЯм пара),18,6, E. coli лейцил системы (Ecих/tRNAлеиCUA пара)28 и архей pyrrolysyl системы (PylRS/тРНК Пыль пара)3, whereby tRNAпыль природного янтаря супрессор. В общем каждый ncAA признается специализированных ncAARS. В зависимости от структуры ncAA ncAARS получается через направленной эволюции TyrRS, их или PylRS, хотя некоторые синтетаз может принимать более одного ncAA.
Ортогональные пара импортируется в клетки, просто используя вектор плазмиды. Наиболее распространенных и эффективных плазмид являются bicistronic и кодирования для синтетаза и тРНК, образуя ортогональных пара29. Второй плазмида кодировки для белка процентные янтаря кодон на сайте, предназначенные для модификации совместно transfected. NcAA просто добавляется к среднего роста клеток. Однако различные специализированные группы часто используют различные варианты конструкций плазмида даже для включения же ncAA. Конструкции отличаются расположения генов в вектор, тип синтетаза, использование кодон в синтетаза гена, Чистая Промоутер, вариант тРНК и количество кассет выражений тРНКГлу. Кроме того включение эффективность различных ncAAs могут сильно варьироваться из-за различных каталитической эффективности различных синтетаз, качество tRNA и другие факторы30. Таким образом важно иметь под рукой быстрый и надежный метод для оценки эффективности ортогональных пары, как выбрать наиболее подходящую систему для нужного приложения, так и для выполнения некоторых шагов оптимизации, которые улучшают общее выражение протеина урожайность.
Мы создали простой и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар29 (рис. 1). В assay клетки совместно transfected с кодировкой плазмиду для ортогональных пары, вместе с bicistronic репортер плазмида кодирования для зеленого флуоресцентного белка, принимая янтаря стоп-кодон в либеральной позиции (тегEGFP) и mCherry ген. Красный и зеленый флуоресценции целом-lysates клетки считываются в отдельных каналов на пластины читателя в 96-луночных пластине. Интенсивность флуоресценции зеленый напрямую коррелирует с эффективности работы автожелтого подавления, тогда как интенсивность флуоресценции Красного дает прямую оценку размера измеряемых образца и эффективность трансфекции. В отношении подобных анализов на основе флуоресценции вспомогательной ячейки, сортируя (FACS) зачитывает31,32, assay дает немедленное и всеобъемлющей оценки экспрессии белков клеточных населения, которая больше Представитель обычно экспериментальных условиях и предлагает упростить сбор и обработка данных со стандартным программным обеспечением. В целом основным преимуществом assay является, что от среднего до большого числа проб могут быть проанализированы параллельно. Используя этот assay, мы экранированный рационально разработан библиотека подавитель tRNAs для повышения эффективности Pyl ортогональные системы30. Эта работа описывает экспериментальный протокол для выполнения этот assay и показать примеры его применения, включая оптимизацию ортогональных пары для включения фото сшивки ncAA p-azido-L-фенилаланин (Ази) и сравнение Включение эффективность различных аминокислот (рис. 2).
За последние годы ncAA инструменты доказали очень мощный для изучения структурных и функциональных аспектов G-белка в сочетании рецепторов (GPCR)33,34,35,,3637 , 38. в организме человека, GPCR образуют большой семьи мембранных рецепторов (800 членов) и представляют собой главных мишеней для лекарственных средств. Прямые структурных характеристик GPCR еще сложной и весьма взаимодополняющими биохимические методы необходимы для их расследования. Мы первыми начали использовать Фото сшивки ncAAs карта GPCR поверхностей и обнаружить лигандом привязки карманы34. Используя наши оптимизированные системы для включения Ази, мы систематически учитываются Azi на протяжении всей juxtamembrane области GPCR непосредственно в живых клетках млекопитающих. После УФ-облучения Ази образует Высокореактивная nitrene видов, которые ковалентно захватывает соседних молекул. Когда лигандом добавляется к системе, Ази служит близость зонд выявить, какие позиции рецептора близко связанных лигандов. Таким образом режим привязки гормон нейропептида Urocortin I (Ucn1) на класс B GPCR АКТГ выпуская фактор рецептор типа 1 (CRF1R)33 был впервые открыт. В последнее время мы раскрыли собственный привязки шаблонов агонисты и антагонисты на же рецептора38. Аналогичный подход применяется другими раскрыть orthosteric и аллостерический привязки сайтов других пептидов и малых молекул лигандов на других GPCR39,40,,4142. Эта рукопись описывает экспериментальный протокол, применяется в нашей лаборатории для фото сшивки сопоставления GPCR поверхностей. Метод относительно быстро, просто и не требует никакого специального оборудования, так что это применимо в лабораториях стандартных биохимии. Важно отметить, что этот подход обеспечивает ценный инструмент не только для идентификации сайтов связывания лиганд, где 3D структурных данных не хватает, но и дополнить существующие в vitro данные с информацией от полностью post-translationally модифицированных рецепторов в физиологической среды живой клетки.
Недавнее развитие Роман ncAAs подшипника на стороне цепочки химических групп подходит для сверхбыстрой бесплатно катализатор bioorthogonal химии открыло возможность установки последнего поколения флуорофоров для супер-резолюции изображений в белки непосредственно на живой клетки2,43. Такие химические анкеры включают напряженными cyclooctyne в SCOK14, nonyne бицикло [6.1.0] в BCNK12,17и транс cyclooctenes в ТШО * K13,15,17 среди других ncAAs укрывательство норборненом16,17,44 или cyclopropene45,группу в составе46 . Громоздкие ncAAs bioorthogonal химии, включаются в вариант PylRS, обычно обозначается как PylRSAF (указанием мутации Y271A и Y349F в . м. barkeri PylRS), а также других специальных развивались ncAARSs17 , 44. анкер bioorthogonal реагируют с тетразина реагенты47 через обратные электрон спрос Дильса-Альдера циклоприсоединения давать высокие урожаи маркировки в течение нескольких минут43,48. Однако применение этого мощного подхода к этикетке GPCR была сложной из-за низкой общей эффективности системы ортогональных ncAA включение. С помощью нашей усовершенствованной системы пыль, мы недавно продемонстрировали высокодоходные включение таких аминокислот в GPCR и сверхскоростной GPCR маркировки на поверхности живой клетки млекопитающих30. Приклеенные этикетку рецепторы были до сих пор функциональна, как они физиологически внутреннюю активировав с агонистом рецепторов. Экспериментальный протокол для включения bioorthogonal якоря в GPCR и следующие маркировки шаги описаны здесь. Оснащение GPCR небольшие яркие флуорофоров является первый основной шаг к изучению GPCR структурной динамики в живой клетке через микроскопии передовых методов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

Генетическая включение неканонических аминокислот (ncAAs) через желтый остановка кодон подавления является мощный метод для установки искусственных зондов и реактивной постановление на белки непосредственно в живой клетке. Каждый ncAA включены выделенный ортогональных подавитель tRNA/амино ацил ТРНК синтетазы (ОРСЕ) пару, которая импортируется в организме хозяина. Включение эффективность различных ncAAs может значительно отличаются и неудовлетворительным в некоторых случаях. Ортогональные пар может быть улучшена путем манипулирования ОРСЕ или тРНК. Однако направленной эволюции tRNA или ОРСЕ, использование больших библиотек и методы выбора мертвых/жив не осуществимо в mammalian клетках. Здесь представлен поверхностным и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар в mammalian клетках. Assay позволяет скрининг десятков до сотен вариантов ОРСЕ/tRNA с умеренным усилием и в разумные сроки. Использование этого анализа для создания новых tRNAs, которые значительно улучшают эффективность системы ортогональных Пирролизин описан, наряду с применением ncAAs к изучению G-белка в сочетании рецепторов (GPCR), которые являются сложными объектами для ncAA мутагенез. Во-первых путем систематического включения фото сшивки ncAA по всей поверхности внеклеточного рецептора, сайтов связывания различных лигандов на нетронутыми рецептор сопоставляются непосредственно в живой клетке. Во-вторых, путем включения последнего поколения ncAAs в GPCR, сверхскоростной катализатор свободных рецепторов маркировки с флуоресцентной краской свидетельствует, который эксплуатирует bioorthogonal штамма повышен обратная Дильс ольха циклоприсоединения (SPIEDAC) на живую клетку. Как ncAAs правило может применяться к любой белок, независимо от его размера, метод имеет общий интерес для ряда приложений. Кроме того ncAA включение не требует никакого специального оборудования и легко выполняется в лабораториях стандартных биохимии.

Наброски флуоресценции assay изображен на рисунке 1. В трех приложениях используется assay. В первую очередь проверяются несколько вариантов tRNA для включения Lys(Boc) пыль ортогональных парой. Lys(Boc) это аминокислота труднодоступных похож на пыль. Как пыль не яв?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Легковесные флуоресценции пробирного представлен для оценки эффективности амино ацил тРНКГлу синтетаза/tRNA пар включению белков в клетках млекопитающих неканонических амино кислот (ncAAs). Описывается применение ncAAs учиться G-протеин рецепторов (GPCR), включая фото сшивки отображение привязки сайтов и bioorthogonal GPCR маркировки на живые клетки.

Оптимизации генетическим включение химического зондов в GPCR для фото сшивки картирования и Bioorthogonal химии в живых клетках млекопитающих

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Простой и быстрый протокол для измерения нейтральных липидов в клетках водорослей с помощью флуоресцентной

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Химическое осаждение из органической Магнит, ванадия тетрацианоэтиленом

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Секвенирование растений стены Heteroxylans Использование ферментативной, химической (метилирование) и физический (масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс) Методики

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Иммобилизация Multi-биокатализаторов в альгинатные гранулы для регенерации кофактора и улучшены возможности повторного использования

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

Получение и свойства Thermo-обратимо Поперечно-сшитый Резина Via Дильса-Альдера химии

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Исследования в взаимодействий аминокислот и пептидов с использованием неорганических материалов с использованием одномолекулярной силовой микроскопии

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Подготовка и оценка<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc меченных тридентатной хелатов для предварительной ориентации Использование биоортогональные реакции

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...