Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Este trabajo ha sido fundado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en subvenciones CO822/2-1 (programa de Noether del Premio Emmy) y CO822/3-1 a I.C.

1. fluorescencia basada en la proyección de las eficiencias de incorporación (figura 1)
<ol><li>Mantener las células HEK293 en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM; alta glucosa, glutamina 4 mM, piruvato) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2.</li>
	<li>Las células de la semilla la transfección de víspera.<ol>
<li>Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C e...

El protocolo describe un ensayo sencillo y fiable para evaluar la eficiencia de pares ortogonales para la incorporación de ncAAs proteínas expresadas en células de mamíferos. La principal ventaja de este método con respecto a ensayos ampliamente utilizados basado en FACS es que permite la realización simultánea y medición de un número mayor de muestras y proporciona datos que se analizan fácilmente utilizando un software normal. La disponibilidad de un método de mediano rendimiento para analizar pares orthogon...

La incorporación genética de sondas químicas a las proteínas es un método poderoso para facilitar la investigación de los aspectos estructurales y dinámicos de la función de la proteína directamente en el contexto natural de la célula viva. Hoy en día, cientos de no-canónico aminoácidos (ncAAs) equipados con los más dispares grupos químicos pueden site-specifically incorporados a proteínas por biosíntesis1,2,3,4. Entre ellos, uno encuentra ncAAs fotosensibles tales como foto-reticulantes5, Foto enjaulado6,7,8,9 y foto conmutable aminoácidos10, 11, aminoácidos, teniendo tensas alquenos y alquinos para bioorthogonal libre de catalizador química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos con dansilo18, cumarina9,19y21 fluoróforos de prodan20,y aminoácidos equipados con otros sondeos biofísicas como así como con post traslacional modificaciones1,2,3,4,22,23,24,25.
La codificación genética de un ncAA está habilitada por una dedicada amino-acil-tRNA-sintetasa (AARS) junto a un cognado supresor-tRNA, que incorpora la ncAA en respuesta a un codón ámbar durante la síntesis ribosomal regular. pares de ncAARS/tRNA están diseñados para ser ortogonales en el organismo del anfitrión, es decir, no interferencia con los pares endógenos. La técnica está bien establecida tanto en hosts de procariotas y eucariotas y las células fácilmente aplicables a mamíferos. Pares para la incorporación de la ncAA en células de mamífero se basan en tres sistemas ortogonales principales: el sistema de Tirosil, que combina la TyrRS de e. coli26 con un supresor de Tirosil ámbar de B. stearothermophilus27 (CE TyrRS /Bstpar de ñame), la e. coli leucina sistema (CELeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 y el sistema de pyrrolysyl de archaeal (PylRS/tRNA Pyl par)3, por el que el tRNAPyl es un supresor natural de color ámbar. En general, cada ncAA es reconocido por un ncAARS especializado. Dependiendo de la estructura de la ncAA, la ncAARS se obtiene mediante evolución dirigida TyrRS, LeuRS o PylRS, aunque algunos sintetasas pueden aceptar más de un ncAA.
El par orthogonal se importa dentro de las células utilizando simplemente un vector plásmido. Más común y eficientes plásmidos son bicistronic y codifican para la sintetasa y el ARNt formando el par orthogonal29. Un segundo plásmido de codificación para la proteína de interés con un codón ámbar en el sitio señalado para la modificación es co transfected. La ncAA se agrega simplemente al medio de crecimiento de la célula. Sin embargo, diferentes grupos especializados utilizan diversas variantes del plásmido construcciones incluso para la incorporación de la ncAA mismo. Construcciones difieren en el arreglo de los genes en el vector, tipo de la sintetasa, uso del codón en el gene de la ligasa, uso de promotor, variante del tRNA y el número de casetes de expresión tRNA. Por otra parte, la eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs puede variar drásticamente debido a la diferente eficacia catalítica de las sintetasas diferentes, la calidad de los tRNA y otros factores30. Por lo tanto, es importante disponer de un método rápido y confiable para evaluar la eficacia de un par orthogonal, elegir el sistema más adecuado para una aplicación deseada y realizar algunas medidas de optimización que mejoran la expresión de la proteína total rendimientos.
Hemos establecido un análisis simple y robusto basada en fluorescencia, para evaluar la eficiencia de pares orthogonal29 (figura 1). En el ensayo, las células son co transfected con el plásmido de codificación para el par orthogonal, junto con un plásmido de reportero bicistronic de codificación para la proteína verde fluorescente con un codón ámbar en una posición permisiva (EGFPetiqueta) y la mCherry gene. Fluorescencia roja y verde de Lisados celulares se leen en canales separados en un lector de placas en una placa de 96 pocillos. La intensidad de la fluorescencia verde se correlaciona directamente con la eficacia de la supresión de ámbar, mientras que la intensidad de fluorescencia roja da una estimación directa del tamaño de la muestra medida y la eficiencia de transfección. Con respecto a ensayos similares basados en fluorescencia celular asistida clasificación (FACS) leer31,32, el ensayo da una evaluación inmediata y completa de expresión de la proteína en la población de células enteras, que es más representativo de las condiciones experimentales usuales y ofrece una fácil adquisición de datos y procesamiento con software estándar. En general, la principal ventaja del ensayo es que un medio a un gran número de muestras puede analizarse en paralelo. Usando este análisis, hemos defendido una biblioteca racionalmente diseñada de supresor-tRNAs para mejorar la eficiencia de la Pyl sistema ortogonal30. Este trabajo describe el protocolo experimental para realizar este análisis y mostrar ejemplos de su aplicación, incluyendo la optimización del par ortogonal para la incorporación de la foto-reticulación ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) y la comparación de eficacia de la incorporación de aminoácidos diferentes (figura 2).
En los últimos años, herramientas de la ncAA se han demostrado muy potentes para investigar estructurales y aspectos funcionales de la proteína G acoplada a los receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. en los seres humanos, GPCRs forman una gran familia de receptores de membrana (800 miembros) y representan los principales objetivos para las drogas terapéuticas. Caracterización directa de los GPCRs es todavía un reto y métodos bioquímicos complementarios son muy necesarios para su investigación. Hemos sido pionero en el uso de foto-reticulación ncAAs superficies GPCR y descubrir ligando vinculante bolsillos34. Utilizando nuestro sistema optimizado para la incorporación de Azi, incorporamos sistemáticamente Azi en todo el dominio del juxtamembrane entero de un GPCR directamente en células de mamífero vivo. Sobre la irradiación UV, Azi forma una especie de nitrene altamente reactivo que captura covalentemente moléculas vecinas. Cuando el ligando se agrega al sistema, Azi sirve como sonda de proximidad para revelar qué posiciones del receptor se acercan al ligand encuadernado. De esta manera, el modo de unión de la hormona neuropéptido Urocortin tipo I (Ucn1) en el receptor de la clase B GPCR corticotropin-lanzar-factor 1 (CRF1R)33 primero se dio a conocer. Últimamente, hemos revelado patrones de enlace distinto de agonistas y antagonistas sobre el receptor mismo38. Un enfoque similar se ha aplicado por otros orthosteric y sitios de Unión alostérica de otros péptidos y pequeñas moléculas ligandos de otros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito describe el protocolo experimental aplicado en nuestro laboratorio para la foto-reticulación asignación de superficies GPCR. El método es relativamente rápido, sencillo y no requiere ningún equipo especial, por lo que es aplicable en los laboratorios de bioquímica estándar. Lo importante es el enfoque proporciona una herramienta valiosa no sólo para identificar sitios de unión del ligando donde escasean los datos estructurales 3D, pero también para complementar en vitro los datos existentes con información de receptores completamente postraduccional modificados en el entorno fisiológico de la célula viva.
El reciente desarrollo de novela ncAAs cojinete en el lado cadena grupos químicos adecuados para la química ultrarrápida catalizador-libre bioorthogonal ha abierto la posibilidad de instalar fluoróforos de última generación para la proyección de imagen de súper-resolución en proteínas directamente en la vida de las células2,43. Tales anclajes químicos incluyen cyclooctyne filtrada en SCOK14, nonyne de bicyclo [6.1.0] en BCNK12,17y trans-cyclooctenes en TCO * K13,15,17 entre otros ncAAs albergar un norbornene16,17,44 o cyclopropene45,parte de la46 . NcAAs voluminosos para bioorthogonal química se incorporan por una variante de la PylRS generalmente se denota como PylRSAF (indicando que la mutación Y271A y Y349F en PylRS de Methanosarcina M. ), así como por otras ad hoc evolucionado ncAARSs17 , 44. las anclas de bioorthogonal reaccionan con reactivos de tetrazina47 través de cicloadición de Diels-Alder de demanda electrónica inversa para dar altos rendimientos Etiquetadoras dentro de unos minutos43,48. Sin embargo, aplicación de este enfoque poderoso sello GPCRs ha estado desafiando debido a una baja eficiencia global del sistema de incorporación de ncAA ortogonal. Utilizando nuestro sistema mejorado de Pyl, recientemente hemos demostrado alto rendimiento incorporación de tales aminoácidos GPCRs y ultrarrápida etiquetado GPCR en la superficie de células de mamífero vivo30. Receptores etiquetados fueron todavía funcionales, ya que fisiológicamente internalizado al activar el receptor con un agonista. El protocolo experimental para la incorporación de bioorthogonal anclajes en GPCRs y aquí se describen los siguientes pasos de etiquetado. Equipar a GPCRs con fluoróforos brillante pequeño, es el primer paso fundamental para el estudio de la dinámica estructural de GPCR en la célula viva mediante técnicas de microscopía avanzada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

La incorporación genética de aminoácidos no-canónico (ncAAs) vía supresión de codón de parada ámbar es una técnica poderosa para instalar sondas artificiales y partes de reactivos a las proteínas directamente en la célula viva. Cada ncAA se incorpora por un dedicado par ortogonal de (AARS) supresor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetasa que es importado en el organismo del anfitrión. La eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs grandemente puede diferir y ser insatisfactoria en algunos casos. Pares orthogonal pueden mejorarse mediante la manipulación de la AARS o el tRNA. Sin embargo, evolución dirigida de tRNA o AARS con grandes bibliotecas y métodos de selección muertos/vivos no son factibles en células de mamíferos. Aquí, se presenta un análisis basado en la fluorescencia fácil y robusto para evaluar la eficacia de pares orthogonal en células de mamíferos. El ensayo permite detección de decenas a cientos de variantes AARS/ARNt con un esfuerzo moderado y en un plazo razonable. Uso de este ensayo para generar nuevo tRNAs que mejoran significativamente el rendimiento del sistema ortogonal pyrrolysine es descrito, junto con la solicitud de ncAAs al estudio de la proteína G unida a receptores (GPCRs), que son un reto objetos por ncAA mutagénesis. En primer lugar, incorporando sistemáticamente un ncAA foto-reticulación a lo largo de la superficie extracelular de un receptor, sitios de unión de ligandos diferentes en el receptor intacto se asignan directamente en la célula viva. Segundo, mediante la incorporación de última generación ncAAs en un GPCR, ultrarrápido receptor catalizador-libre de etiquetado con un colorante fluorescente se demuestra, que explota bioorthogonal promovido por la tensión inversa del aliso de Diels cicloadición (SPIEDAC) en la célula viva. Como ncAAs puede aplicarse generalmente a cualquier proteína independientemente de su tamaño, el método es de interés general para un número de aplicaciones. Además, la incorporación de la ncAA no requiere ningún equipo especial y se realiza fácilmente en los laboratorios de bioquímica estándar.

El contorno de la prueba de fluorescencia se representa en la figura 1. El ensayo se emplea en tres aplicaciones. En primer lugar, un número de variantes de tRNA para la incorporación de Lys(Boc) por el par de Pyl ortogonal es evaluado. Lys(BOC) es un aminoácido sterically similar a Pyl. Pyl no esté comercialmente disponible, Lys(Boc) se utiliza comúnmente como un substrato estándar para la PylRS. Los tRNAs seleccionados se basan en el tRNAPyl</sup...

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Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Investigación

Química

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Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

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