Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Detta arbete har grundats av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) under bidrag CO822/2-1 (Emmy-Noether program) och CO822/3-1 till I.C.

1. fluorescens-baserad Screening av inkorporering effektivitetsvinster (figur 1)
<ol><li>Upprätthålla HEK293 celler i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM; hög glukos, 4 mM glutamin, pyruvat) kompletteras med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin vid 37 ° C, 95% luftfuktighet och 5% CO2.</li>
	<li>Utsäde cellerna dagen innan transfection.<ol>
<li>Lossa cellerna för 5 min vid 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS kompletteras med 0...

Protokollet beskrivs ett enkelt och tillförlitligt test för att bedöma effektiviteten av ortogonala par för införlivandet av ncAAs i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Den största fördelen med denna metod i respekt till utbredda analyser baserat på FACS är att den tillåter samtidig beredning och mätning av större antal prover och ger data som analyseras enkelt med en vanlig programvara. Tillgången på en medium-genomströmning metod att analysera ortogonala par i däggdjursceller är mycket viktigt f...

Genetiska införlivandet av kemiska sonder i proteiner är en kraftfull metod för att underlätta utredningen av strukturella och dynamiska aspekterna av proteinfunktion direkt i det inhemska sammanhanget i den levande cellen. Nuförtiden, kan hundratals icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) utrustade med de mest olikartade kemiska grupperna anläggningsvis införlivas i proteiner av biosyntes1,2,3,4. Mellan dem, en finner ljuskänsliga ncAAs som foto-bindemedel5, Foto-bur6,7,8,9 och foto-omkopplingsbar aminosyror10, 11, aminosyror med ansträngda alkener och alkyner för katalysator-fri bioorthogonal kemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyror som transporterar dansyl18, kumarin9,19och prodan20,21 fluorophores och aminosyror som utrustade med övriga biofysiska sonder som väl som med post translationella modifieringar1,2,3,4,22,23,24,25.
Genetiska kodningen av en ncAA aktiveras som en dedikerad amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) ihopkopplade till en cognate suppressor-tRNA, vilken inlemmar ncAA som svar på en bärnstensfärgad stop kodon under regelbunden ribosomal syntesen. ncAARS/tRNA par är konstruerade så att de är ortogonala i värd organismen, dvs inte cross-talk med endogena paren. Tekniken är väl etablerade både i prokaryota och eukaryota värdar och enkelt tillämpas på däggdjurs celler. Par för ncAA inkorporering i däggdjursceller baseras på tre huvudsakliga ortogonalsystem: det tyrosyl systemet, som kombinerar TyrRS från E. coli26 med en tyrosyl bärnsten suppressor från B. stearothermophilus27 (EG TyrRS /BstYam par), i E. coli leucyl system (EGLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 och archaeal pyrrolysyl systemet (PylRS/tRNA Pyl par)3, whereby tRNAenPyl är en naturlig bärnsten suppressor. I allmänhet är varje ncAA erkänd av en specialiserad ncAARS. Beroende på ncAA struktur erhålls ncAARS genom riktad evolution av TyrRS, LeuRS eller PylRS, även om vissa synthetases kan acceptera mer än en ncAA.
Ortogonala paret importeras in i cellerna genom att bara använda en plasmid vektor. Mest gemensam och effektiv plasmider är bicistronic och koda både för kväveoxidsyntas och den tRNAen bildar den ortogonala par29. En andra plasmid kodning för proteinet av räntebärande en bärnstensfärgad kodon på den plats som utsetts för modifiering är samtidig transfekterade. NcAA är helt enkelt läggas till cell odlingsmedium. Dock använder olika specialiserade grupper ofta olika varianter av Plasmiden konstruktioner även för införlivandet av samma ncAA. Konstruktioner skiljer sig åt i arrangemanget av generna i vektor, typ av kväveoxidsyntas, kodon användning i kväveoxidsyntas genen, promotorn användning, variant av tRNA och antal tRNA uttryck kassetter. Dessutom kan införlivandet effektiviteten i olika ncAAs varierar drastiskt på grund av de olika synthetases, kvaliteten på tRNAen, och andra faktorer30olika katalytiska effektivitet. Därför är det viktigt att ha till hands en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma effektiviteten av en ortogonal par, både att välja det lämpligaste systemet för ett önskat program och utföra vissa optimering steg som förbättrar övergripande proteinuttryck avkastning.
Vi har etablerat en enkel och robust fluorescens-baserad analys för att bedöma effektiviteten av ortogonala par29 (figur 1). I analysen, cellerna är samtidig transfekterade med plasmid kodning för rätvinkliga par, tillsammans med en bicistronic reporter plasmid kodning både för grönt fluorescerande protein med en bärnstensfärgad stop kodon vid en tillåtande position (andraTAG) och den mCherry gen. Röd och grön fluorescens av hela-cell lysates läses i separata kanaler på en tallrik läsare i en plattan med 96 brunnar. Intensiteten på den gröna fluorescensen korrelerar direkt med effektiviteten i bärnsten dämpning, medan intensiteten i röd fluorescens ger en direkt uppskattning av storleken på uppmätta provet och transfection effektivitet. Med avseende på liknande analyser baserat på fluorescens läsa assisterad cell sortering (FACS) upp31,32, analysen ger en omedelbar och omfattande bedömning av proteinuttryck i hela cellen befolkningen, som är mer representativa för vanliga experimentella förhållanden, och erbjuder en lättare datainsamling och bearbetning med standardprogramvara. Övergripande, den största fördelen med analysen är att ett medium till ett stort antal prover kan analyseras parallellt. Med denna analys, har vi ett rationellt designade bibliotek med suppressor-tRNAs att förbättra effektiviteten av Pyl ortogonala systemet30. Detta arbete beskriver det experimentellt protokollet för att utföra denna analys och visar exempel på sin ansökan, inklusive optimering av det ortogonala paret för införlivandet av den foto-crosslinking ncAA p-azid-L-fenylalanin (Azi) och jämförelse av inkorporering effektivitet av olika aminosyror (figur 2).
De senaste åren, ncAA verktyg har visat mycket kraftfullt att undersöka strukturella och funktionella aspekter av G-protein kopplade receptorer (varandra)33,34,35,36,37 , 38. i människor, varandra bildar en stor familj med membranreceptorer (800 medlemmar) och representerar huvudsakliga mål för terapeutiska läkemedel. Direkta strukturell karaktärisering av varandra är fortfarande utmanande och kompletterande biokemiska metoder behövs mycket för deras utredning. Vi har börjat använda sig av foto-crosslinking ncAAs att kartlägga GPCR ytor och upptäck ligand bindande fickor34. Använda vårt optimerade system för Azi iblandning, införlivas vi systematiskt Azi i hela domänen hela juxtamembrane av en GPCR direkt i levande däggdjursceller. Vid UV-bestrålning bildar Azi en mycket reaktiva nitrene arter som kovalent fångar närliggande molekyler. När liganden läggs till systemet, fungerar Azi som en närhet sond att avslöja vilka positioner av receptorn komma nära den bundna liganden. På detta sätt avtäcktes först bindande funktionsläget av neuropeptid hormonet Urocortin I (Ucn1) på klass B GPCR corticotropin-släppa-factor receptor typ 1 (CRF1R)33 . Nyligen, har vi lämnat ut distinkta bindande mönster av agonister och antagonister på samma receptor38. En liknande metod har tillämpats av andra att avslöja orthosteric och Alloster bindningsställen andra peptider och småmolekylära ligander på andra varandra39,40,41,42. Detta manuskript beskriver den experimentellt protokoll tillämpas i vårt labb för foto-crosslinking kartläggning av GPCR ytor. Metoden är relativt snabb och enkel och kräver inte någon särskild utrustning, så att den är tillämplig i standard biokemi labs. Allt metoden erbjuder ett värdefullt verktyg inte bara att identifiera liganden bindande platser där 3D grunddata är knappa, men också att komplettera befintliga in vitro- data med information från fullt post-translationally modifierade receptorer i den fysiologiska miljön i den levande cellen.
Den senaste utvecklingen av Roman ncAAs bär på side chain kemiska grupperna lämplig för ultrasnabb katalysator-fri bioorthogonal kemi har öppnat upp möjligheten att installera senaste generationens fluorophores för super-upplösning imaging i proteiner direkt på levande celler2,43. Sådana kemiska ankare inkluderar ansträngda cyclooctyne SCOK14, etylbicyklo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, och trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 bland andra ncAAs hysa en norbornen16,17,44 eller Otillagade45,46 biexponentiellt. Skrymmande ncAAs för bioorthogonal kemi införlivas genom en variant av den PylRS som brukar betecknas som PylRSAF (som anger mutation Y271A och Y349F i M. barkeri PylRS), as well as vid andra ad hoc- utvecklats ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankare reagerar med tetrazine reagens47 via omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen att ge märkning kickavkastningar inom några minuter43,48. Dock tillämpningen av denna kraftfulla metod till etiketten varandra har varit en utmaning på grund av en låg övergripande effektivitet ortogonala ncAA inkorporering. Med vår förbättrade Pyl-systemet, har vi nyligen visat hög avkastning införlivandet av sådana aminosyror i varandra och ultrasnabb GPCR märkning på ytan av levande däggdjursceller30. Märkt receptorer var fortfarande funktionella, som de internaliserat fysiologiskt vid aktivering av receptorn med en agonist. Det experimentella protokollet för införlivandet av bioorthogonal ankare i varandra och följande märkning steg beskrivs här. Förse varandra med små ljusa fluorophores är det första grundläggande steget mot studiet av GPCR strukturell dynamik i den levande cellen via avancerad mikroskopi tekniker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

Genetiska införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) via bärnsten stop kodon dämpning är en kraftfull teknik för att installera konstgjorda sonder och reaktiva delarna på proteiner direkt i den levande cellen. Varje ncAA införlivas genom en dedikerad ortogonala suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) par som importeras in i värd organismen. Inkorporering effektivitet av olika ncAAs kan skilja sig, och vara otillfredsställande i vissa fall. Ortogonala par kan förbättras genom att manipulera de årliga verksamhetsrapporterna eller tRNAen. Dock riktad evolution av tRNA eller AARS använder stora bibliotek och döda/levande urvalsmetoder inte är genomförbara i däggdjursceller. Här presenteras en lättköpt och robust fluorescens-baserad analys att utvärdera effektiviteten i ortogonala par i däggdjursceller. Analysen kan screening tiotals till hundratals AARS/tRNA varianter med en måttlig ansträngning och inom rimlig tid. Användning av denna analys att generera nya tRNAs att avsevärt förbättrar effektiviteten i pyrrolysine ortogonala systemet beskrivs, tillsammans med tillämpning av ncAAs på studiet av G-protein kopplade receptorer (varandra), vilket är en utmaning objekt för ncAA mutagenes. Först, genom att systematiskt införliva en foto-crosslinking ncAA i hela extracellulära ytan av en receptor, bindande platser av olika ligander på intakt receptorn mappas direkt i den levande cellen. Andra, genom att införliva senaste generationens ncAAs i en GPCR, ultrasnabb katalysator-fri receptor märkning med ett fluorescerande färgämne demonstreras, som utnyttjar bioorthogonal stam-främjade inverse Diels-Alder cykloadditionen (SPIEDAC) på den levande cellen. Som ncAAs kan tillämpas generellt på något protein självständigt på dess storlek, är metoden av allmänt intresse för ett antal applikationer. Dessutom ncAA inkorporering kräver inte någon särskild utrustning och utförs enkelt i standard biokemi labs.

Skissera av fluorescens analysen avbildas i figur 1. Analysen är anställd i tre program. I första hand undersöks ett antal tRNA varianter för inkorporering av Lys(Boc) av Pyl ortogonala paret. Lys(BOC) är en aminosyra som är koalisera liknar Pyl. Eftersom Pyl inte är kommersiellt tillgängliga, används ofta Lys(Boc) som standard substrat för PylRS. De kontrollerade tRNAsna är baserade på tRNAenPyl. Varje tRNA-variant bär mutationer av ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

En lättköpt fluorescens analysen presenteras för att bedöma effektiviteten av amino-acyl-tRNA-syntetas/tRNA par införliva icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Tillämpningen av ncAAs att studera G-protein kopplade receptorer (varandra) beskrivs, inklusive foto-crosslinking kartläggning av bindande platser och bioorthogonal GPCR märkning på levande celler.

Optimera genetiska införlivandet av kemiska sonder till varandra för foto-crosslinking kartläggning och Bioorthogonal kemi i levande däggdjursceller

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering och kemisk karakterisering av lipid A från gramnegativa bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

En enkel och snabb protokoll för mätning av neutrala lipider i algceller Använda Fluorescens

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Chemical Vapor Deposition av en organisk magnet, Vanadium tetracyanoeten

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av växt Wall Heteroxylans Använda enzym, Chemical (metylering) och fysiska (masspektrometri, kärnmagnetisk resonans) Tekniker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Immobilisering av Multi-biokatalysatorer i alginatpärlor för Cofactor Regeneration och förbättrad Återanvändning

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

Framställningen och egenskaperna av Thermo-reversibelt tvärbundet gummi Via Diels-Alder kemi

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Insikter Interaktioner av aminosyror och peptider med oorganiska material med hjälp av enda molekyl Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Beredning och utvärdering av<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-märkt tridentat Chelates för Pre-inriktning Använda Bioorthogonal kemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...