Name: optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Bu eser tarafından Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibe CO822/2-1 (Emmy Noether programı) ve CO822/3-1 için araç ten altında kurulan

1. Floresans tabanlı tarama birleşme verimliliği (şekil 1)
<ol><li>Dulbecco'nın modifiye kartal orta HEK293 hücreleri korumak (DMEM; yüksek glikoz, 4 mM glutamin, pyruvate) % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Tohum hücreleri transfection önceki gün.<ol>
<li>Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de 5 dakika ayır. 1 mL ...

Protokol ncAAs birleşme memeli hücrelerinde proteinlerin içine dik çiftleri verimliliğini değerlendirmek için basit ve güvenilir bir tahlil açıklar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan deneyleri FACS üzerinde dayalı açısından büyük avantajı bu eşzamanlı hazırlanması ve örnekleri daha büyük sayıda ölçüm sağlar ve kolayca sıradan bir yazılım kullanılarak analiz veri sağlar olduğunu. Dik memeli hücreleri çiftinde analiz etmek için bir orta-den geçerek yöntem kullanılabilirliği me...

Kimyasal probları genetik birleşme proteinlerin içine protein işlevi doğrudan canlı hücre yerli bağlamında yapısal ve dinamik yönleriyle incelenmesi kolaylaştırmak için güçlü bir yöntemdir. Günümüzde, kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) en farklı kimyasal gruplar ile donatılmış yüzlerce site-specifically protein biyosentezi1,2,3,4tarafından eklenebilir. Aralarında, bir fotoğraf-crosslinkers5, fotoğraf Kafesli6,7,8,9 ve fotoğraf değiştirilebilir amino asitler10, gibi fotoğraf duyarlı ncAAs bulur 11, amino asitler taşıyan gergin alkenes ve alkynes catalyst-Alerjik bioorthogonal kimya2,12,13,14,15,16 ,17, dansyl18, coumarin9,19ve prodan20,21 fluorophores taşıyan amino asitleri ve amino asitler biyofiziksel diğer probları ile donatılmış sonrası translasyonel modifikasyonlar1,2,3,4,22,23,24,ile25gibi iyi.
Genetik bir ncAA kodlama bir adanmış amino-asil-tRNA-ncAA yanıt olarak bir kehribar kodonu düzenli ribozomal sentezi sırasında birleştirmek soydaş bir bastırıcı-tRNA için eşleştirilmiş sentetaz (AARS) tarafından etkinleştirilir. ncAARS/tRNA çiftleri konak canlı, Yani değil çapraz-endojen çiftiyle hadis dik olacak şekilde tasarlanmıştır. Prokaryotik ve ökaryotik ana bilgisayarlar ve kolayca uygulanabilir memeli hücreleri hem de iyi kurulmuş bir tekniktir. Memeli hücrelerinde ncAA birleşme için çift üç ana ortogonal sistemlerinde temel alır: E. coli26 TyrRS bir tyrosyl amber bastırıcı B. stearothermophilus27 (Ec ile birleştiren tyrosyl sistemi TyrRS /BstYam çift), E. coli leucyl sistemi (EcLeuRS/tRNALeuCUA çifti)6,18,28 ve arke pyrrolysyl sistemi (PylRS/tRNA Pyl çifti)3, tRNAPyl bu sayede doğal kehribar bastırıcı. Genel olarak, her ncAA tarafından özel bir ncAARS tanınır. Her ne kadar bazı sentetaz birden fazla ncAA kabul edebilir ncAA yapısına bağlı olarak, ncAARS TyrRS, LeuRS veya PylRS, yönlendirilmiş evrim elde edilir.
Ortogonal çifti sadece bir plazmid vektör kullanarak hücre içine alınır. En yaygın ve etkin plazmid ortogonal çifti29şekillendirme tRNA sentetaz hem de encode ve bicistronic vardır. Kodlama değişikliği için belirlenmiş sitesinde bir kehribar kodon faizli protein için ikinci plazmid co transfected. NcAA sadece hücre büyüme ortamına eklenir. Ancak, farklı özel gruplar genellikle plazmid yapıları farklı türevleri bile aynı ncAA birleşme için kullanın. Düzenleme vektör, sentetaz türünü, kodon kullanım sentetaz gen, organizatörü kullanımı, değişken tRNA ve tRNA ifade kaset sayısı genlerin yapıları farklı. Ayrıca, farklı ncAAs birleşme verimliliği nedeniyle farklı katalitik verimini farklı sentetaz, tRNA ve diğer faktörler30kalitesini büyük ölçüde değişebilir. Bu nedenle, el altında dik çiftinin en uygun sistemi için istediğiniz uygulamayı seçin ve genel protein ifade geliştirmek bazı optimizasyon adımları gerçekleştirmek için verimliliğini değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem olması önemlidir verir.
Biz dik çiftleri29 (şekil 1) verimliliğini değerlendirmek için bir basit ve sağlam Floresans tabanlı tahlil kurduk. Assay olarak, plazmid ile birlikte her ikisi için bir kehribar kodonu izin veren bir konumda (EGFPetiketi) taşıyan yeşil flüoresan protein kodlama bicistronic muhabir plazmid ortogonal çifti için kodlama ile ortak transfected hücrelerdir ve mCherry gen. Bütün hücreli lysates kırmızı ve yeşil floresan bir plaka okuyucu bir 96-şey plaka üzerinde ayrı kanallarda okuyun. Kırmızı Floresans yoğunluğunu transfection etkinlik ve ölçülen örnek boyutunun doğrudan bir tahmin verir ise yeşil floresan yoğunluğu doğrudan kehribar giderme, verimliliği ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Floresans üzerinde dayalı benzer deneyleri ile ilgili olarak yardımlı hücre (FACS) sıralama okumak31,32, tahlil protein ifade acil ve kapsamlı bir değerlendirmesini daha fazla olan tüm cep telefonu topluluk içinde verir. Her zamanki deneysel koşullar, temsilcisi ve bir daha kolay veri toplama ve işleme standart yazılım ile sunmaktadır. Genel olarak, en büyük avantajı tahlil örnekleri çok sayıda orta paralel olarak analiz edilebilir olduğunu. Bu tahlil kullanarak, bastırıcı-tRNA Pyl ortogonal sistem30verimliliğini artırmak için mantıklı bir şekilde tasarlanmış bir kütüphane ekranlı. Bu eser bu tahlil gerçekleştirmek ve fotoğraf-crosslinking ncAA p-azido-L-fenilalanin (Polat) birleşme ortogonal çiftinin optimizasyonu ve karşılaştırılması gibi onun uygulama örnekleri göstermek için deneysel protokolünü açıklar birleşme verimliliği farklı amino asit (Şekil 2).
Geçen yıllar boyunca, yapısal araştırmak için çok güçlü kanıtlanmış ncAA araçları ve reseptörleri (GPCRs)33,34,35,36,37 G-protein fonksiyonel yönleri birleştiğinde , 38. insanlarda, GPCRs membran reseptörleri (800 üye) büyük bir aile oluşturmak ve tedavi edici ilaçlar için ana hedefleri temsil eder. GPCRs doğrudan yapısal karakterizasyonu hala meydan okuyor ve tamamlayıcı biyokimyasal yöntem son derece onların soruşturma için ihtiyaç vardır. Fotoğraf-çapraz ncAAs GPCR yüzeyler harita ve ligand bağlayıcı cepler34keşfetmek için kullanılmasına öncülük etmiştir. Polat birleşme için en iyi duruma getirilmiş sistemimizi kullanarak, biz sistematik olarak Polat GPCR canlı memeli hücrelerinde doğrudan, Bütün juxtamembrane etki alanı dahil. UV ışınlama Polat komşu molekülleri kovalent yakalar bir büyük ölçüde reaktif nitrene tür oluşturur. Ligand sisteme eklendiğinde, Polat hangi pozisyonlar reseptör ilişkili ligand yakın gel ortaya çıkarmak için bir yakınlık sonda olarak hizmet vermektedir. Bu şekilde, peptit hormon Urocortin ı (Ucn1) Sınıf B GPCR kortikotropin-serbest-faktör reseptör tarihinde 1 (CRF1R)33 tipi bağlama modu ilk açıldı. Son zamanlarda, farklı bağlama kalıpları agonistleri ve antagonistleri tarihinde aynı reseptör38ifşa. Benzer bir yaklaşım, orthosteric ve allosteric bağlayıcı siteleri diğer peptidler ve küçük molekül ligandlar tarihinde diğer GPCRs39,40,41,42ortaya çıkarmak için başkaları tarafından uygulanmıştır. Bu el yazması GPCR yüzeyler, fotoğraf-crosslinking eşleştirilmesine bizim laboratuvarında uygulanan deneysel protokolünü açıklar. Yöntem nispeten hızlı, basit ve böylece standart Biyokimya laboratuvarlarında uygulanabilir herhangi bir özel bir donanım gerektirmez. Önemlisi, yaklaşım sadece 3D yapısal verileri nerede kıt ligand bağlayıcı siteleri tanımlamak için aynı zamanda tam olarak post-translationally tarihinde reseptörleri üzerinden bilgileriyle varolan vitro verileri ek olarak değerli bir araç sağlar canlı hücre fizyolojik ortamı.
Roman ncAAs yan zinciri kimyasal gruplarında ultrafast katalizör-Alerjik bioorthogonal Kimya için uygun taşıyan son gelişme olasılığı son nesil fluorophores süper kararlılık düşsel için protein yüklemek için açtı 2,43doğrudan canlı hücreleri. Bu tür kimyasal dübel gergin cyclooctyne dahil SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17ve trans-cyclooctenes toplam sahip olma maliyeti içinde * K13,15,17 diğer ncAAs arasında norbornene16,17,44 veya cyclopropene45,46 yan yataklık. Bioorthogonal kimya hantal ncAAs genellikle PylRSAF ile belirtilen PylRS varyanta göre dahil (mutasyon gösteren Y271A ve M. barkeri PylRS Y349F), yanı sıra diğer gelişti geçici ncAARSs tarafından17 gibi , 44. bioorthogonal çapa yüksek etiketleme verim içinde birkaç dakika43,48vermek için ters elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition via tetrazine reaktifler47 ile tepki. Ancak, uygulama için etiket GPCRs güçlü Bu yaklaşımın ortogonal ncAA birleşme sistem düşük bir genel verimliliğini nedeniyle zor oldu. Gelişmiş Pyl sistemimizi kullanarak, son zamanlarda yüksek verimli birleşme gibi amino asitler GPCRs ve ultrafast GPCR canlı memeli hücreleri30yüzeyinde etiketleme göstermiştir. Fizyolojik bir agonist ile reseptör aktif hale getirildiğinde içselleştirilmiş gibi etiketli reseptörleri hala fonksiyonel. Deneysel protokol bioorthogonal birleşme GPCRs tutturur ve aşağıdaki etiketleme adımları burada açıklanmıştır. GPCRs küçük parlak fluorophores ile donatılması ilk temel doğru GPCR yapısal dinamiklerin canlı hücredeki çalışma yolu ile gelişmiş mikroskobu teknikleri adımdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Azidophenylalanine (Azi)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>F-3075.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenolblue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8540430100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&#160;</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&#160; p-coumaric acid in DMSO ; 30&#160;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2185,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0082.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Gr&#252;ssing</td>
			<td>121551000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9008-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>11548876 (15140-122)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P0704L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk Powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazine-Cy3</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-014-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)</td>
			<td>Sichem</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasserstoffperoxid (30%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07210.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td>
			<td>ACC-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td>
			<td>Bio-Budget Technologies GmbH</td>
			<td>40-BLX-E365</td>
			<td>5 x 8 Watt tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid E2AziRS</td>
			<td>The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POI-TAG mutant plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRF1R-95TAG-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrestin3-FLAG</td>
			<td>Synthesized by Genart (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td>Cloned in the MCS of pcDNA3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8592&#160;</td>
			<td>monoclonal, produced in mouse clone M2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-CRF antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #rC69</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td>
			<td>home-made</td>
			<td>PBL #5779</td>
			<td>polyclonal [Turnbull]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the genetic incorporation of chemical probes into gpcrs for photo-crosslinking mapping and bioorthogonal chemistry in live mammalian cells

Kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) yolu ile amber stop kodonu bastırma genetik birleşme yapay sonda ve reaktif moieties proteinleri üzerine doğrudan canlı hücre içinde yüklemek için güçlü bir tekniktir. Her ncAA ana bilgisayar organizma ithal bir adanmış ortogonal bastırıcı-tRNA/amino-asil-tRNA-sentetaz (AARS) çifti tarafından kurulmuştur. Farklı ncAAs birleşme verimliliğini büyük ölçüde farklılık gösterebilir ve bazı durumlarda yetersiz. Ortogonal çiftleri AARS veya tRNA manipüle ederek geliştirilebilir. Ancak, yönlendirilmiş evrim tRNA veya büyük kütüphaneler ve ölü/canlı seçim yöntemlerini kullanarak AARS değildir uygun memeli hücrelerinde. Burada, dik memeli hücreleri çiftinde verimliliğini değerlendirmek için bir facile ve sağlam Floresans tabanlı tahlil sunulur. Tahlil onlarca AARS/tRNA değişik bir orta çaba ile ve makul bir süre içinde yüzlerce tarama sağlar. Kullanım pyrrolysine ortogonal sisteminin performansını önemli ölçüde artıran yeni tRNA oluşturmak için bu testin anlatılan, ncAAs uygulamaya G-protein çalışmanın yanı sıra nesneleri ncAA için zorlu reseptörleri (GPCRs), birleşince mutagenesis. İlk olarak, sistematik bir reseptör ekstraselüler yüzeyi boyunca fotoğraf-crosslinking ncAA birleşmeyle, bozulmamış reseptör üzerinde farklı ligandlar bağlama siteleri doğrudan canlı hücre içinde eşleştirilir. İkinci, son nesil ncAAs bir GPCR birleşmeyle, floresan bir boya ile ultrafast katalizör-Alerjik reseptör etiketleme, hangi bioorthogonal zorlanma terfi ters Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) canlı hücre üzerinde olağanüstü başarı gösterilmiştir. NcAAs genellikle herhangi bir protein boyutuna üzerinde bağımsız olarak uygulanabilir gibi uygulamalar için genel ilgi yöntemidir. Buna ek olarak, ncAA birleşme herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve standart Biyokimya laboratuvarlarında kolayca gerçekleştirilir.

Floresans tahlil anahat şekil 1' de tasvir edilir. Tahlil üç uygulamalarda istihdam edilmektedir. İlk etapta tRNA türevleri Lys(Boc) Pyl ortogonal çifti tarafından birleşme için bir dizi ekranlı. Lys(Boc) Pyl için sterically benzer bir amino asittir. Pyl ticari olarak mevcut olmadığı gibi Lys(Boc) standart bir substrat PylRS için yaygın olarak kullanılır. Filtrelenmiş tRNA tRNA üzerinde temel alanPyl. Her tRNA değişken tek üs...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells at JoVE.

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

The overall goal of this protocol is to enhance the incorporation rate of non-canonical amino acids in mammalian cells to tackle biological questions in live cell settings including mapping of protein-protein interaction surfaces, and bioorthogonal labeling of surface receptors. Using amber codon suppression, different non-canonical amino acids are incorporated with different efficiencies. We established fluorescence assay to easily compare non-canonical amino acids incorporation rates in mammalian cells within a short time.The systematic incorporation of photo-crosslinking, non-canonical amino acids through our GPCR surfaces allows mapping of ligand binding sites and provides precious information of the intake receptor directly from the life cell. By incorporating last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry, we achieve site-specific, super fast, catalyst free labeling of GPCRs with small, bright fluorophores for high-end imaging applications in live mammalian cells. First, seed 600, 000 HEK 293 cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.Prepare as many wells as the number of samples and two additional wells for the wild type EGFP and a mock transfected sample respectively. One hour prior to transfection, add the appropriate amount of freshly prepared non-canonical amino acid stock solution to all wells for a final amino acid concentration of 0.25 to 0.5 millimolar. To transfect the cells, mix one microgram of plasmid DNA and coding for the synthetase t-RNA pair to be tested with one microgram of reporter plasmid DNA in a microcentrifuge tube.In separate tubes, prepare an identical transfection using the EGFP wild type reference and a mock transfection. Next, add 100 microliters of lactate buffered saline to each tube containing the DNA. After briefly mixing, add six microliters of one microgram per microliter PEI and lactate buffered saline to each tube.Vortex immediately, and then incubate at room temperature for 10 to 15 minutes. Transfer 400 microliters of cell medium from each well to the DNA PEI mixture to neutralize the pH. Then, dribble the DNA mixture onto the cells.Harvest the cells 48 hours post-transfection by aspirating the medium and rinsing the cells once with two milliliters of pre-warmed PBS. Add 800 microliters of PBS supplemented with 0.5 millimolar EDTA, and incubate for 20 minutes at 37 degrees Celsius. After incubation, detach and suspend the cells by pipetting up and down.Next, transfer the cell suspension into microcentrifuge tubes containing 200 microliters of PBS supplemented with five millimolar magnesium chloride. Centrifuge the samples for two minutes at 800 times gravity. When finished, discard the supernatant.Now, add 100 microliters of Tris lysis buffer to the cell pellets and incubate on ice for 30 minutes. To facilitate lysis, vortex every five minutes. Spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity.Transfer 90 microliters of the supernatant into black 96-well plates. Then, measure EGFP and mCherry fluorescence using a plate reader equipped with the fluorescence module. Seed 500, 000 293 t-cells in two milliliters of complete growth medium per well in two six-well plates.For each position to be screened, prepare one well per ligand, plus one well for the binding control. One hour prior to transfection, add the photo-crosslinker, p-azidophenylalanine, or Azi, to all wells to a final concentration of 0.5 millimolar. Transfect a total amount of two micrograms of DNA per well using one microgram of plasmid and coding for the flag tagged GPCR bearing a tag codon at the desired position, and one microgram of the plasmid and coding for the orthogonal pair dedicated to Azi.At 48 hours post-transfection, prepare a 1, 000x ligand stock solution by dissolving the peptide ligand at a concentration of 100 micromolar in DMSO. Dilute the ligand stock solution one to 1, 000 in binding buffer. Replace the cell medium with one milliliter of the ligand solution and incubate the samples for 10 minutes at room temperature.Following incubation, irradiate the cells for 20 minutes in a UV cross-linker at 365 nanometers and five centimeter distance to the cells. When finished, detach the cells by pipetting and transfer them into a microcentrifuge tube. Pellet the cells for three minutes at 800 times gravity.After discarding the supernatant, resuspend the cell pellets in 50 microliters of HEPES dissociation buffer, or HDB, containing a cocktail of protease inhibitors. Then, flash freeze the cells in liquid nitrogen. Next, thaw the cells in a water bath at 37 degrees Celsius for 30 to 45 seconds, and then vortex briefly.Pellet the membranes for 10 minutes at four degrees Celsius and 2500 times gravity. When finished, discard the supernatant which contains the bulk of cytosolic proteins. Thoroughly resuspend the pellets in 50 microliters of HEPES lysis buffer using a pipet.Then, lyse the cells for 30 minutes on ice, vortexing every five minutes. Following this, spin down the cell debris for 10 minutes at four degrees Celsius and 14, 000 times gravity. Immediately transfer each supernatant to a fresh reaction tube for western blot analysis.When the GPCR is glycosylated and faint or smeared bands are a problem in western blot analysis, deglycosylate the samples with PNGase F to increase signal intensity and sharpen the bands. Then, resolve the samples on standard SDS page and blot transfer proteins to a PVDF membrane. After blocking the membrane, probe it with an anti-ligand antibody to detect the occurrence of cross-linking.To detect the expression level of the Azi-GPCR, probe the membrane with a commercial anti-flag antibody. After washing the membrane, soak it in enhanced chemiluminescence solution, and visualize the signals in the dark. Seed 100, 000 HEK 293 t-cells in 600 microliters of dye-free, complete DMEM per well of a microscopy slide equipped with four wells.One hour prior to transfection, prepare a fresh 100 millimolar stock solution of TCOK and 0.2 molar sodium hydroxide and 15%DMSO. Mix three microliters of the TCOK stock solution with 12 microliters of one molar, pH 7.4 HEPES buffer. Gently add the solution to each well for a final TCOK concentration of 0.5 millimolar.In a microcentrifuge tube, dilute 200 nanograms of the plasmid and coding for the receptor containing the amber codon and 200 nanograms of the plasmid and coding for the orthogonal pair in 50 microliters of medium. Dilute 1.25 microliters of lipofectamine 2, 000 in 50 microliters of dye-free, serum-free, and antibiotic-free medium, and add the solution to the DNA solution. Vortex immediately and incubate for five to 10 minutes at room temperature.Then, add the DNA lipid complexes to the cells. At 24 hours post-transfection, transfer 100 microliters of medium from each well into a 1.5 milliliter reaction tube. Add 1.8 microliters of an orange fluorescent dye tetrazine stock solution, and 0.3 microliters of a DNA staining dye stock solution.Transfer the medium containing the dyes back to the well and incubate for five minutes at 37 degrees Celsius. Aspirate the medium, and gently rinse the cells twice with PBS to remove the excess dye. Then, add 600 microliters of pre-heated, complete dye-free growth medium to the cells.Now, visualize the labeled receptors under 63x magnification using filters appropriate for GFP orange fluorescent dye and DNA-staining dye. After adding peptide agonist stock solution to the cells, observe the internalization under the microscope using the aforementioned filters and take pictures after the clearly detectable occurrence of internalization. Different tRNA's give different suppression efficiency, which is clearly reflected in the amount of measured fluorescence.Azi incorporation into CRF1R was highly enhanced when using the codon-optimized Azi-tRNA synthetase gene compared to the native gene, showing that even a moderate improvement for a soluble protein can have a greater impact on the expression level of more challenging membrane proteins. The optimized system for Azi incorporation, including the humanized E2 Azi RS gene was deployed to map the binding pocket of the CRF1R and to find binding paths of five ligands. A band at the correct size of the crosslinking product in the western blot reveals that the position lies in the proximity of the ligand within the ligand receptor complex.Multiple crosslinking hits with all ligands tested revealed distinct binding patterns for the peptide Agonists and Antagonists. Both fluorescence and western blot data suggests that TCOK is the non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry that gets incorporated with the highest efficiency of the AF variant of the paralysine tRNA synthetase. TCOK was incorporated into a CRF1R EGFP fusion protein and enabled installing a small, bright fluorophore on the receptor.After adding a peptide Agaonist, fluorescent compartments were observed throughout the cytosol, revealing the physiological process of GPCR internalization. To do a fluorescence assay, we presented here is a simple and effective tool to evaluate and optimize the efficiency of a synthetase TI and API in mammalian cells. High incorporation rates are crucial for applying non-canonical amino acids to investigate challenging biological questions.Highly efficient incorporation of crosslinking non-canonical amino acids enables extensive surface mapping of virtually any protein, including membrane receptors or low-banded proteins. The method reveals the topology of interaction interfaces which can be further analyzed to obtain accurate molecular models. High incorporation efficiency of last generation, non-canonical amino acids for bioorthogonal chemistry allows us to equip GPCRs with small, bright fluorophores, thus leading the way towards the study of GPCRs structural dynamics in live cells via advanced microscopy techniques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Bir Organik Magnet CVD, Vanadyum Tetracyanoethylene

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

Termo-tersinir Çapraz bağlı Lastik Via Diels-Alder Kimya hazırlanması ve Özellikleri

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Hazırlama ve Değerlendirilmesi<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...