Name: three-dimensional rendering and analysis of immunolabeled, clarified human placental villous vascular networks
Uploaded: 2018-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks at JoVE.com

यह काम विकास विकलांग और अपरा विश्लेषिकी LLC, नई रोशेल, NY के साथ लोगों के लिए ंयूयॉर्क राज्य कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया ।

यह प्रोटोकॉल विकास विकलांग मानव अनुसंधान आचार समिति में बुनियादी अनुसंधान के लिए ंयूयॉर्क राज्य संस्थान के दिशा निर्देशों का पालन करता है ।
१. Villous वृक्ष विच्छेदन
<ol><li>कुल्ला formalin फॉस्फेट शौकी...

<ol>
	<li>Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+features+of+placental+programming.">Biological features of placental programming.</a> Placenta. 48, 47-53 (2016).</li><li>Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+weights+smaller+or+larger+than+the+placenta+predict+BMI+and+blood+pressure+at+age+7+years.">Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years.</a> J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).</li><li>Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+Origins+of+Chronic+Disease.">Placental Origins of Chronic Disease.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).</li><li>Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+study+of+villous+capillary+lesions+in+complicated+pregnancies.">A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies.</a> J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).</li><li>Jones, C. J. P., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+possible+function+for+placental+pericytes.">A new possible function for placental pericytes.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).</li><li>Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histomorphometric+study+of+placental+villi+vascular+volume+in+toxemia+and+diabetes.">Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes.</a> Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).</li><li>Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transcriptional+activity+in+the+syncytiotrophoblast+of+the+human+placenta.">Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta.</a> Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).</li><li>Jirkovsk&#225;, M., Kub&#237;nov&#225;, L., Jan&#225;&#269;ek, J., Kal&#225;b, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+study+of+vessels+in+peripheral+placental+villi.">3-D study of vessels in peripheral placental villi.</a> Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).</li><li>Pearce, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Modeling+of+Blood+Flow+and+Oxygen+Transfer+in+Feto-Placental+Capillaries.">Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).</li><li>Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+modeling+of+the+structure-function+relationship+in+human+placental+terminal+villi.">Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi.</a> J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).</li><li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stereological+perspective+on+placental+morphology+in+normal+and+complicated+pregnancies.">A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies.</a> J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).</li><li>Teasdale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+changes+in+the+functional+structure+of+the+human+placenta+in+relation+to+fetal+growth:+a+morphometric+study.">Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study.</a> Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses.">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).</li><li>Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+oxygen+transport+in+human+placental+terminal+villi.">Modeling oxygen transport in human placental terminal villi.</a> J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).</li><li>Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modeling+of+human+placental+terminal+villi.">Three-dimensional modeling of human placental terminal villi.</a> Placenta. 43, 54-60 (2016).</li></ol>

संस्थागत समीक्षा बोर्ड ने ऐच्छिक रूप से समाप्त गर्भधारण से formalin निर्धारण के लिए अपरा villous ऊतकों के संग्रह को मंजूरी दी. इससे पहले कि प्रक्रियाओं, चिकित्सा रिकॉर्ड की एक संक्षिप्त समीक्षा प्रदर्शन किया ग?...

अपरा विकासशील और उसके विकृतियों की हमारी समझ है, बड़े माप में, आसंन विल्ली और निहित केशिकाओं ऊतकवैज्ञानिक वर्गों से व्युत्पंन के बीच आस्थगित स्थानिक संबंधों को सीमित । इस अध्ययन में, हम मानव अपरा केशिका नेटवर्क है कि केशिका नेटवर्क सुविधाओं (जैसे शाखाकरण, ठोसता) के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है के तीन आयामी (3 डी) प्रतिपादन उत्पंन करने के लिए साधन विकसित करके इस मुद्दे को संबोधित किया है । ऐसा करने के लिए हम दो वाणिज्यिक ऊतक समाशोधन उत्पादों, Visikol-1 और Visikol-2 के साथ धुंधला immunofluorescent संयुक्त है (समाधान के रूप में नीचे निर्दिष्ट-1 और समाधान-2) ।
मानव अपरा मां के intervillous रक्त और विकासशील भ्रूण के बीच इंटरफेस पर स्थित रक्त वाहिकाओं का एक विशाल परिसर है । chorionic प्लेट में अपनी प्रविष्टि से बाहर का विस्तार, धमनियों और नसों के एक नेटवर्क है कि ramify एक विस्तृत संवहनी नेटवर्क के साथ chorionic सतह को कवर करने के लिए गर्भनाल शाखाओं में । उनके सिरों तो आंतरिक या अपरा डिस्क की गहराई में नीचे घुसना, जहां वे कई और शाखाओं में पीढ़ियों और अंत टर्मिनल विल्ली और उनके निहित केशिका नेटवर्क से गुजरना, गैसों, पोषक तत्वों के आदान प्रदान की साइट, और चयापचय भ्रूण और मातृ रक्त के बीच अपशिष्ट ।
विकास के दौरान अपरा केशिका नेटवर्क के लिए अपमान भ्रूण, नवजात शिशु और आकस्मिक वयस्क 1,2,3के स्वास्थ्य के लिए स्थाई परिणाम है । गर्भपात, अंतर्गर्भाशयी वृद्धि प्रतिबंध, पूर्व प्रसवाक्षेप और मातृ मधुमेह के रूप में गर्भावस्था से संबंधित विकृतियों को ध्यान में रखते हुए 4,5,6 वहाँ माप के तरीकों के विकास पर रखा एक उच्च मूल्य है और अपरा villous केशिका नेटवर्क का लक्षण वर्णन । एक प्रमुख अंधी गली है कि अपरा संवहनी नेटवर्क पैमाने की एक व्यापक रेंज शामिल है । सतह संवहनी नेटवर्क व्यास में 4-5 मिमी के रूप में के रूप में महान हो सकता है । टर्मिनल villous केशिकाओं व्यास में 10 -20 µm के आदेश पर कर रहे हैं; अपरा रक्त वाहिकाओं के 300 से अधिक 7किमी होता है । वर्तमान में, वहां कुछ उपयोग करने के लिए आसान है और तेजी से तकनीक है कि पोत पैमाने के इन अतिवाद पर कब्जा कर सकते हैं । तिथि करने के लिए, केवल विल्ली की एक छोटी संख्या माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Jirkovska एट अल. अपरा अंकुर पर शब्द पर ध्यान केंद्रित, धारावाहिक ऑप्टिकल वर्गों के साथ 1 µm अंतराल 120 µm मोटी वर्गों से प्राप्त पर फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन; नमूनों की संख्या पर कोई डेटा नहीं अध्ययन किया गया और न ही आंकड़े 8प्रदान किए गए थे. केशिका संरचनाओं की पहचान की गई, और विल्ली और केशिकाओं की आकृति हाथ से तैयार की गई, छवि विश्लेषण के लिए निर्यात अनुरेखण के साथ थे । जबकि लेखक "बढ़ती villous संवहनी नेटवर्क" के लिए अपने निष्कर्षों के निहितार्थ पर चर्चा, ऐसे निष्कर्ष समस्याग्रस्त है जब केवल "शब्द" (36 + सप्ताह गर्भावधि उंर) ऊतक का अध्ययन किया है । इसी तरह, मेयो एट एएल और Pearce एट अल. रक्त प्रवाह और ऑक्सीजन हस्तांतरण के अपने सिमुलेशन के लिए, एक ही उम्र के ऊतकों पर भरोसा किया, लेकिन उनके विश्लेषण केवल कुछ शब्द तक ही सीमित थे, टर्मिनल विल्ली 9,10 . Stereology भी villous जहाजों की संरचना के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । लेकिन फिर, ध्यान आम तौर पर एक या एक से अधिक गर्भावस्था जटिलताओं 11,12के साथ liveborn शिशुओं को वितरित बाद में गर्भधारण पर किया गया है ।
हाल ही में जब तक, फोकल माइक्रोस्कोपी की वजह से उत्तेजना और प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन के अवशोषण की वजह से १००-२०० µm के ऊतक गहराई को इमेजिंग करने के लिए सीमित था 13 । हालांकि ऊतक समाशोधन और 3 डी प्रोटोकॉल व्यापक रूप से साहित्य में वर्णित किया गया है और वहां ऊतक समाशोधन के लिए कई तरीके है सामांय में ऊतकों के साथ प्रयोग के लिए अनुपयुक्त हैं, के रूप में वे hyperhydration के माध्यम से अचल क्षति सेलुलर आकृति विज्ञान प्रोटीन या लिपिड को हटाने की । इसलिए, यह संभव है कि इन परिणामों के ऊतक ही नहीं है और हमारे ऊतक समाशोधन प्रक्रिया जबकि प्रसंस्करण से कलाकृतियों का संकेत कर रहे है कि एक प्रतिवर्ती तकनीक है कि पारंपरिक प्रोटोकॉल के खिलाफ मांय करने में सक्षम है मांय नहीं है । ऊतक समाशोधन आम तौर पर तीन प्रमुख दृष्टिकोण में से एक शामिल है: 1) डुबकी द्वारा आरआई मिलान समाधान में ऊतक घटकों के अपवर्तन सूचकांक (आरआई) के समान मिलान, जो संचयी प्रकाश बिखरने की वजह से लेंस से निकलती निरंतर कम आरआई (cytosol) और उच्च आरआई (प्रोटीन/लिपिड) घटक के उतार-चढ़ाव; 2) hydrogel में embedding के माध्यम से लिपिड घटकों को हटाने और ट्रो का उपयोग/लिपिड घटकों को हटाने के लिए प्रसार; 3) विकार/प्रोटीन संरचना के विस्तार की अनुमति के लिए सॉल्वैंट्स की पैठ में वृद्धि आरआई की एकरूपता को प्रोत्साहित करने के लिए 13। हालांकि इन तरीकों के ऊतकों को पारदर्शी प्रदान कर सकते है और के लिए अनुमति के 3 डी अभ्यावेदन के लिए उत्पंन हो, इन 3 डी अभ्यावेदन संदिग्ध नैदानिक मूल्य के है क्योंकि यह निर्धारित अगर इन छवियों ऊतक गुणों का संकेत कर रहे है चुनौतीपूर्ण है या ऊतक समाशोधन प्रक्रिया की । दूसरी ओर, के बाद से हमारे ऊतक समाशोधन प्रतिवर्ती मानक ऊतकवैज्ञानिक और/या immunohistochemistry एक ही ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है मूल्यांकन करने के लिए कि परिवर्तन नैदानिक महत्वपूर्ण हैं ।
इस अध्ययन के 47 बाहर villous नमूने के एक कुल से प्राप्त की एक विश्लेषण प्रस्तुत करता है 23 नैदानिक सामांय और वैकल्पिक 9-23 पूरा ' सप्ताह हमल और दो पूर्ण अवधि के सामांय प्रसव के बीच गर्भधारण समाप्त । trophoblast और endothelia के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग villous संवहनी नेटवर्क और उनकी जटिलता में परिवर्तन का एक मात्रात्मक और स्वचालित विश्लेषण सक्षम है ।
इस प्रोटोकॉल के साथ, हम अलग और पहले से संभव नहीं पैमाने पर टर्मिनल विल्ली और उनके केशिका नेटवर्क का विश्लेषण किया । इस दृष्टिकोण, जब villous और गर्भावधि भर में केशिका नेटवर्क विकास के लिए लागू उन संपत्तियों है कि एक स्वस्थ बच्चे के जंम के लिए नींव है की पहचान करेगा । जब जटिल गर्भधारण के अध्ययन के लिए आवेदन किया, यह भी स्पष्ट है जब और कैसे अपरा विकृतियों villous पेड़ और केशिका नेटवर्क वे म्यान, और कैसे भ्रूण भलाई पर इन को बदलने को संशोधित करेगा ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1277px;" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:435px;">10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer</td>
			<td style="width:199px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">H-121-08</td>
			<td style="width:517px;">General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">08-916-5B No. 11</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">08-913-5</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:127px;">78354-119</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Tube (1.7 mL)</td>
			<td style="width:199px;">PGC Scientifics</td>
			<td style="width:127px;">505-201</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">D8537</td>
			<td style="width:517px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">52947-948</td>
			<td style="width:517px;">disposable, 3ml transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:199px;">Boehriner Mannheim</td>
			<td style="width:127px;">789 704</td>
			<td style="width:517px;">Dilute to 0.1% from stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:199px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">16210-064</td>
			<td style="width:517px;">Dilute to 2% in PBS solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">MS-1352-RQ</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab28364</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">green emitting (520 nm) fluorochrome&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A11017</td>
			<td style="width:517px;">Alexa-Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">infrared emitting (652 nm) fluorochrome</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A21072</td>
			<td style="width:517px;">Alexa Fluor 633</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ethanol alcohol 200 proof</td>
			<td style="width:199px;">Pharmco-Aaper</td>
			<td style="width:127px;">111000200</td>
			<td style="width:517px;">Dilute down to lower concentrations using PBS as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution-1</td>
			<td style="width:199px;">Visikol Inc.</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:517px;">Visikol Histo-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution-2</td>
			<td style="width:199px;">Visikol Inc.</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:517px;">Visikol Histo-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skyes-Moore chambers</td>
			<td style="width:199px;">BellCo Glass Inc.</td>
			<td style="width:127px;">P/N 1943-11111</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">14-826AA</td>
			<td style="width:517px;">BD Precision Glide Needes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">14-823-40</td>
			<td style="width:517px;">BD disposable syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDMS silicon sheets</td>
			<td style="width:199px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:127px;">P/N 578T31</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon Inc.</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:517px;">Nikon C1 Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deconvolution software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:517px;">AutoQuant X22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiji image processing software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:517px;">free, Open source&#160; software available at https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:199px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;">3801570</td>
			<td style="width:517px;">Component 1 of SelecTech H&#38;E staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcoholic Eosin</td>
			<td style="width:199px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;">3801615</td>
			<td style="width:517px;">Component 2 of SelecTech H&#38;E staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Buffer</td>
			<td style="width:199px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;">3802918</td>
			<td style="width:517px;">Component 3 of SelecTech H&#38;E staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aqua Define MCX</td>
			<td style="width:199px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;">3803598</td>
			<td style="width:517px;">Component 4 of SelecTech H&#38;E staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:435px;">Immunohistochemistry detection system</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">TL-125-QHD</td>
			<td>UltraVision Quanto Detection System HRP DAB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional rendering and analysis of immunolabeled, clarified human placental villous vascular networks

माता और भ्रूण के बीच पोषक तत्व और गैस विनिमय मातृ intervillous रक्त के इंटरफेस पर होता है और विशाल villous केशिका नेटवर्क है जो मानव अपरा के पैरेन्काइमा को ज्यादा बनाता है । बाहर villous केशिका नेटवर्क नाल गर्भनाल से बाहर का विस्तार जहाजों की शाखाओं में बंटी की कई पीढ़ियों के बाद भ्रूण रक्त की आपूर्ति के टर्मिनस है । इस नेटवर्क में एक निरंतर सेलुलर म्यान, syncytial trophoblast बाधा परत है, जो भ्रूण रक्त और मातृ रक्त में यह लगातार स्नान किया जाता है के मिश्रण से बचाता है । अपरा केशिका नेटवर्क की अखंडता के लिए अपमान, इस तरह के मातृ मधुमेह, उच्च रक्तचाप और मोटापे के रूप में विकारों में होने वाली, भ्रूण, शिशु, और वयस्क के लिए गंभीर स्वास्थ्य जोखिम मौजूद है कि परिणाम है. बेहतर इन अपमान के संरचनात्मक प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, एक प्रोटोकॉल इस अध्ययन है कि 1-2mm 3 के आदेश पर केशिका नेटवर्क संरचना कब्जा है जिसमें एक अपनी पूरी जटिलता में अपनी टोपोलॉजिकल सुविधाओं की जांच कर सकते है के लिए विकसित किया गया था । यह पूरा करने के लिए, अपरा से टर्मिनल विल्ली के समूहों को विच्छेदित कर रहे हैं, और trophoblast परत और केशिका endothelia immunolabeled हैं । इन नमूनों तो एक नया ऊतक समाशोधन प्रक्रिया है जो यह संभव z करने के लिए फोकल छवि स्टैक प्राप्त करने के लिए बनाता है के साथ स्पष्ट कर रहे हैं ~ 1 मिमी की गहराई. इन ढेर के तीन आयामी renderings तो संसाधित कर रहे है और विश्लेषण के लिए मूल केशिका नेटवर्क उपाय जैसे मात्रा, केशिका शाखाओं की संख्या, और केशिका शाखा अंत अंक, के लिए इस दृष्टिकोण की उपयुक्तता के सत्यापन के रूप में उत्पंन केशिका नेटवर्क लक्षण वर्णन ।

8 सप्ताह से अवधि के वितरण के लिए गर्भावधि उंर से मानव अपरा में टर्मिनल विल्ली के समूहों में केशिकाओं के 3 डी renderings व्यक्तिगत समूहों और नेटवर्क विश्लेषण के लिए कंकाल के रूप में गिना गया । अपरा क?...

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

इस अध्ययन प्रतिवर्ती ऊतक समाशोधन, immunostaining, 3 डी प्रतिपादन और मानव अपरा विल्ली नमूनों में संवहनी नेटवर्क के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल 1-2mm3 के आदेश पर प्रस्तुत करता है ।

तीन आयामी प्रतिपादन और Immunolabeled का विश्लेषण, स्पष्ट मानव अपरा Villous संवहनी नेटवर्क

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

The overall goal of this procedure is to generate three-D renderings of placental villous tree fragments that are suitable for the analysis of their contained vascular networks. This method can help us answer key questions in our field, such as why a child may be growth restricted or what stress and how severe the stress might have been that lead to pre-term birth. The main advantage of our procedure is that we are now in a position to immunolabel clear placental villous tree tissue and then visualize their vascular networks and use those visualizations to characterize and analyze these vascular networks.The implications of this technique can extend into many diagnoses and therapies since most life sciences rely on two-dimensional histological characterization. Demonstrating the procedure will be Ms.Valerie Schwenk who will be carrying out the immunolabeling and clearing of the placental tissue and then Mr.Phillip Necaise will be doing the dissection of the placental tissue and doing also the reverse clearing of the tissue. To prepare for the dissection of the villous tree, first rinse the formal and fixed placental tissue with phosphate buffered saline.Then place in a petri dish on the stage of a dissection microscope. To locate the villous tree, use scalpel and fine forceps to tear the placental tissue apart. Then, dissect pieces of the villous tree approximately five millimeters in length and transfer into a microtube containing one milliliter of phosphate buffered saline.Replace the phosphate buffered saline with a fresh one and wait for 10 minutes with occasional swirling. Then, replace the phosphate buffered saline with permeabilizing buffer to permeabilize the tissue and block non-specific binding of secondary antibodies. Then, incubate for 30 minutes.Then, replace the permeabilizing buffer with phosphate buffered saline containing two percent goat serum with mouse monoclonal anti CD31 and rabbit anti CK7. Leave the tissue at four degrees Celsius over night. The following day, remove the remaining antibodies with additional washes with phosphate buffered saline with two percent goat serum.Then, remove the phosphate buffered saline with two percent goat serum and add the same buffer, supplemented with goat anti-mouse immunoglobulin G coupled with a green fluorophore and goat anti-rabbit immunoglobulin G coupled with an infrared fluorophore. Incubate for 30 minutes in the dark at room temperature. Then, wash the tissue once with PBS-GS and store labeled tissue in the dark at room temperature until clearing.Wash the samples three times with PBS at 10 minute intervals. To dehydrate the tissue, remove the phosphate buffered saline and add 50%ethanol to the tissue and incubate for 10 minutes. After incubation, discard and subsequently wash three times with 70%ethanol at 10 minute intervals followed by three washes with 100%ethanol at 15 minute intervals.Then, use fine tipped forceps to transfer the tissue to a microtube filled with one milliliter of solution one for four hours. After four hours, transfer the tissue to a microtube filled with solution two and incubate for another four hours. To mount the tissue in a Sykes-Moore Chamber use fine-tipped forceps to position a 25 millimeter round cover slip on the chamber base.Again, use the fine-tipped forceps to place a rubber gasket in the base on the cover slip. Remove the tissue immersed in solution two and place it on the center of the cover slip. Then, add a drop of solution two, approximately 40 microliters, onto the tissue.Then, take a second cover slip and place it on top of the gasket. Then, compress the cover slip and the gasket firmly by threading a locking ring into the top of the base. Then, insert a 25 gauge needle through the gasket into the port on the base.Next, fill a three milliliter syringe with one point five milliliters of solution two. Then, mount a 25 gauge needle on the syringe and insert the needle in the opposite port through the gasket. Then, start injecting the chamber with solution two and check that the air inside the chamber is venting through the other 25 gauge needle.When the chamber is full, remove the needle and syringe and place the Sykes-Moore chamber holder on the confocal microscope stage. Use a 10X objective to focus the tissue placed on the chamber. Next, set a reference point for the stage and move the microscope stage up and down through the focal plane to identify and set the top and bottom of the tissue.Set the step size to two point five micrometers and collect a confocal image file containing a set of images of the tissue from top to bottom. Then, transfer the tissue to a microtube containing more than 20 times the volume of 100%ethanol to reverse the clearing. Then, after every one hour interval, replace with 70 and next with 50%ethanol and finally phosphate buffered saline.Store at four degrees Celsius in the dark until embedding. Here, to show the placental vascular network, both microscopic and confocal microscopic images of a human placenta, have been acquired. These microscopic images of the placenta show the radiating villous tree that have penetrated the placental parenchyma.These microscopic images show the presence of a distal portion of pieces of villous tree terminating in the cluster of villi. Next, to show the trophoblast layer of the villous, the distal portion of the villous tree was immunolabeled. In the image, the outer trophoblast layer is shown in green and the capillaries are shown in red.Then, to check the placental tissue before and after clearing confocal images of uncleared and cleared placental tissues were acquired. The images show that for an uncleared tissue, immunofluorescence can be captured at 100 micrometer or lesser depth of the tissue. On the contrary, for cleared placental tissue immunofluorescence can be captured at a much higher depth.Further, to compare the conventional tissue with the reversed clear sections, the cleared tissue was dehydrated in a reverse process with ethanol. The immunohistochemical staining of the placental tissue with anti CK7 before and after clearing demonstrate no significant alteration in the tissue morphology due to clearing. The animation shows that the immunostained villous tissue is distributed along the whole depth of the tissue volume.Once you're comfortable doing the procedure you can expect it to take about 18 hours, split out across three days. In attempting to do this procedure it is important to remember that it requires several different skill sets. One needs to be able to do placental pathology, confocal microscopy.You need to be able to generate three-D renderings of the imaging, and you need to be able to be conversant in immuno processing and analysis. Following this procedure, other methods like traditional histology, STS page, or maldi can be conducted. With its development, this technique paves the way in the field of maternal fetal medicine, neonatology and trophoblast biology to explore the root causes underlying pre-eclampsia, poor fetal growth and fetal distress.After watching this video, you should have a good understanding of how to clear, render, and analyze placental villous tree tissue. Thanks so much for watching the video and good luck with your experiments.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

तीन आयामी संस्कृति, MicroRNA का विश्लेषण और ख्यात लक्ष्य जीन पर एक मानव तंत्रिका स्टेम सेल लाइन के भेदभाव

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न पिरामिड न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines के तीन आयामी मात्रा

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

दो और तीन आयामी embryoid निकायों में मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की रेटिनोइक एसिड प्रेरित तंत्रिका विभेदन का विश्लेषण

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

क्षैतिज पूरे माउंट: मोटा, तीन आयामी ऊतक के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

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High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

तीन आयामी भड़काऊ मानव ऊतक Gingiva के समकक्ष

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Vestibular और श्रवण संवेदी अंगों की तीन आयामी Organotypic संस्कृतियों

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

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पाड़-मुक्त, तीन आयामी इंसुलिन व्यक्त Pancreatoids से माउस अग्नाशय Progenitors इन विट्रो में की पीढ़ी

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

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Vivo में भ्रूण और अपरा विकास के विश्लेषण के लिए उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...