Denne metode kan forbedre screening og udvælgelse af hornhindedonorvæv i øjenbanker, forbedre resultaterne af hornhindetransplantation. Den største fordel ved denne teknik er dens vurderingsevne med høj opløsning, og at hornhinden forbliver nedsænket i et lukket kammer fyldt med lagringsmedium under hele billedoptagelsen, hvilket reducerer enhver potentiel risiko for kontaminering. Maelle Vilbert, ph.d.-kandidat fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren.
Til at begynde med skal du placere hornhinden nedsænket i opbevaringsmediet i prøveholderen med epitelet opad. Placer en ren silicadæksel, der følger med prøveholderen, oven på hornhinden. Luk derefter holderen ved forsigtigt at dreje dens base, indtil prøven er let fladtrykt og immobiliseret under dækselsedlen, hvilket giver en relativt jævn billedoverflade.
Tag forholdsregler for at undgå luftbobler. Påfør et tykt lag oftalmisk eller optisk gel på dækslet slip som nedsænkningsmedium. Initialiser enheden ved at tænde for afbryderen bag på enheden.
Belysning af en grøn LED på forsiden af enheden indikerer, at strømmen er tændt. Sørg for, at billeddannelsestrinnet er klart, bortset fra den bevægelige bakke. Klik derefter på OK i anskaffelsessoftwaren for at initialisere motorerne ved prompten.
Hvis du vil konfigurere enheden, skal du angive et eksempel-id i det angivne og obligatoriske felt. Og indtast eventuelt en prøvebeskrivelse og studiebeskrivelse. Klik derefter på Hent makrobillede for at oprette et øjebliksbillede af eksemplet, der senere kan bruges til lateral positionering og navigation.
Når du er tilfreds, skal du validere billedet ved prompten ved at klikke på Ja. Derefter flytter enheden prøvebakken under målet og udfører en automatisk justering. Sørg for, at mikroskopmålet er godt nedsænket i den optiske gel, før du fortsætter.
Forbered anskaffelsen ved at gå til fanen Udforsk. Før du køber en stak billeder, skal du navigere til midten af hornhinden via joysticket eller manuelt valg på skærmen. Varier billeddybden via rotation af joysticket, justering af skyderen eller manuel tastaturindgang i den grafiske brugergrænseflade.
Juster derefter gennemsnitsværdien til 40 for optimal hornhindebilleddannelse. Indtast hornhindeoverfladeværdien eller den første billedplacering i dybdefeltet. Vælg derefter fanen Hent for at hente billeder.
Vælg og indstil udsnitsafstanden, der svarer til enhedens aksiale opløsning. Angiv hornhindetykkelsesværdien under Antal udsnit. Gennemgå parametre og anskaffelsestid.
Og når du er tilfreds, skal du trykke på OK for at starte overtagelsen. Undgå kontakt med bordet, hvor mikroskopet er placeret under overtagelsen. For at vurdere stromal og Bowmans lagtykkelse måles afstande af hornhindetværsnit.
Tilføj f.eks. fem punkter med lige stor afstand på tværs af tværsnittet som beskrevet i tekstmanuskriptet. Tegn en linje mellem to punkter med kendt afstand i henhold til standardsynsfeltet. Gå derefter til fanen Analysér, og vælg Indstil skala.
Indtast den kendte afstand og længdeenhed i de relevante felter. Indstil til 1024 pixels eller 780 mikrometer, og klik på OK. Tegn en linje mellem to punkter med ukendt afstand, og aflæs længden eller afstanden målt direkte fra statuslinjen. Variationsgennemsnittet og variationskoefficienten registreres.
Klik på fanen Billede, og vælg Reslice Z under Stakke for at bestemme keratinocytdensiteten. Dette vil opsummere stromale ansigtsbilleder i grupper på syv for at producere skiver af sammenlignelig tykkelse. For yderligere analyse skal du inkludere alle tilgængelige ansigtsskiver til det forreste stroma, 15 billeder til det forreste stroma, fem billeder til det midterste stroma, og fem billeder til det bageste stroma.
På hvert billede skal du vælge et interesseområde på 300 x 300 mikrometer. Hvis du vil forbedre kernevisualiseringen, skal du invertere billedet ved hjælp af Inverter under fanen Rediger. Juster kontrast og lysstyrke ved at klikke på fanen Billede og navigere til Lysstyrke-kontrast.
For manuelt at tælle cellekerner skal du gå til Plugins og navigere til Celletæller under fanen Analysér. Tryk på Initialiser, og vælg derefter en tællertype. Tæl derefter cellekernerne ved at klikke på mørke ovale træk i det omvendte billede, idet de kun lander på en billedkant for to af de fire sider af billedet.
Den udvalgte humane donorhornhinde var hævet efter opbevaring i organkulturmedium, hvilket gav en patofysiologisk model af den edematøse hornhinde og forhindrede billedoptagelse gennem hele hornhindetykkelsen på grund af begrænset penetrationsdybde. Overførsel til dextrinsuppleret organkulturmedium, reducerede hævelsen og resulterede i donorhornhinder af normal tykkelse. Syge hornhinder blev anerkendt af morfologiske ændringer og typiske stromale træk, herunder et fald i variabel stromaltykkelse eller Bowmans lag.
Vurdering af keratinocytdensitet og stromal reflektionsevne yderligere hjulpet i histologilignende analyse og differentiering af normalt fra patologisk hornhindevæv med fuldfelts optisk kohærensmikroskopi, hvilket er uden for kapaciteten i kliniske optiske kohærenstomografisystemer. Efter at have set denne video skal du have en god forståelse af, hvordan du udfører kvalitativ og kvantitativ histologilignende analyse af hornhindestromaet, der tillader differentiering af sygdom fra normalt humant hornhindevæv.