Denne metoden kan forbedre screening og utvalg av hornhindedonorvev i øyebanker, forbedre resultatene av hornhindetransplantasjon. Den største fordelen med denne teknikken er dens høyoppløselige vurderingsevne og at hornhinnen forblir nedsenket i et lukket kammer fylt med lagringsmedium gjennom bildeopptak, noe som reduserer potensiell risiko for forurensning. Demonstrere prosedyren vil være Maelle Vilbert, en doktorgrad utdannet fra vårt laboratorium.
For å begynne, plasser hornhinnen nedsenket i lagringsmedium i prøveholderen med epitelet vendt oppover. Plasser en ren silikadekselslip som følger med prøveholderen på toppen av hornhinnen. Lukk deretter holderen ved å vri basen forsiktig til prøven er litt flat og immobilisert under dekselet, noe som gir en relativt jevn bildeoverflate.
Ta forholdsregler for å unngå luftbobler. Påfør et tykt lag oftalmisk eller optisk gel på dekselet som nedsenkningsmedium. Initialiser enheten ved å slå på strømbryteren på baksiden av enheten.
Belysning av en grønn LED på forsiden av enheten indikerer at strømmen er på. Forsikre deg om at avbildningstrinnet er klart, bortsett fra den bevegelige skuffen. Klikk deretter OK i anskaffelsesprogramvaren for å initialisere motorene ved ledeteksten.
Hvis du vil konfigurere enheten, angir du en eksempelidentifikator i det angitte og obligatoriske feltet. Og eventuelt skriv inn en prøvebeskrivelse og studiebeskrivelse. Klikk deretter Hent makrobilde for å opprette et øyeblikksbilde av eksemplet som senere kan brukes til lateral posisjonering og navigasjon.
Når du er fornøyd, validerer du bildet ved ledeteksten ved å klikke Ja. Deretter flytter enheten prøvebrettet under målet og utfører en automatisk justering. Forsikre deg om at mikroskopmålet er godt nedsenket i den optiske gelen før du fortsetter.
Forbered anskaffelsen ved å gå til Utforsk-fanen. Før du kjøper en bunke med bilder, naviger til midten av hornhinnen via joysticken eller manuelt valg på skjermen. Varier bildedybden via rotasjon av joysticken, justering av glidebryteren eller manuell tastaturinngang i det grafiske brukergrensesnittet.
Juster deretter gjennomsnittsverdien til 40 for optimal avbildning av hornhinnen. Skriv inn hornhinnens overflateverdi eller første bildeplassering i dybdefeltet. Velg deretter kategorien Oppkjøp for å hente bilder.
Velg og angi stykkeavstanden som samsvarer med enhetens aksiale oppløsning. Angi verdien for hornhinnenes tykkelse under Antall stykker. Se gjennom parametere og anskaffelsestid.
Og når du er fornøyd, trykk OK for å starte oppkjøpet. Under oppkjøpet, unngå kontakt med bordet som mikroskopet er plassert på. For å vurdere stromal og Bowmans lagtykkelse, måle avstander av hornhinnen tverrsnitt.
Du kan for eksempel legge til fem punkter med lik avstand på tvers av tverrsnittet som beskrevet i tekstmanuskriptet. Tegn en linje mellom to punkter med kjent avstand i henhold til standard synsfelt. Gå deretter til Analyser-fanen og velg Angi skala.
Angi kjent avstand og lengdeenhet i de aktuelle feltene. Sett til 1024 piksler eller 780 mikrometer, og klikk OK. Tegn en linje mellom to punkter med ukjent avstand, og les av lengden eller avstanden målt direkte fra statuslinjen. Registrer gjennomsnittet og variasjonskoeffisienten.
Klikk på Bilde-fanen og velg Replice Z under Stacks for å bestemme keratinocytttettheten. Dette vil summere stromal en face-bildene i grupper på syv for å produsere skiver med sammenlignbar tykkelse. For videre analyse, inkluder alle tilgjengelige ansiktsskiver for fremre mest stroma, 15 bilder for fremre stroma, fem bilder for midtstroma og fem bilder for bakre stroma.
På hvert bilde velger du et område av interesse på 300 x 300 mikrometer. For å forbedre kjernevisualisering, inverter bildet ved hjelp av Inverter under Rediger-fanen. Juster kontrast og lysstyrke ved å klikke på Bilde-fanen og navigere til Lysstyrke-kontrast.
For å telle cellekjerner manuelt, gå til Plugins og naviger til Cell Counter under Analyser-fanen. Trykk på Initialiser, og velg deretter en tellertype. Tell deretter cellekjernene ved å klikke på mørke ovale trekk i det omvendte bildet, med tanke på de som lander på en bildekant bare for to av de fire sidene av bildet.
Den selekterte humane donorhornhinnen var hoven etter lagring i organkulturmedium, noe som ga en patofysiologisk modell av den edematøse hornhinnen og forhindret bildeopptak gjennom hele hornhinnens tykkelse på grunn av begrenset penetrasjonsdybde. Overgang til dekstrinsupplert organkulturmedium, reduserte hevelsen og resulterte i donorhornhinner med normal tykkelse. Syke hornhinner ble anerkjent av morfologiske endringer og typiske stromale trekk, inkludert en reduksjon i variabel stromaltykkelse eller Bowmans lag.
Vurdering av keratinocytttetthet og stromalreflektivitet hjalp videre til histologilignende analyse og differensiering av normalt fra patologisk hornhinnevev med fullfelt optisk koherensmikroskopi, som er utenfor evnen til kliniske optiske koherenstomografisystemer. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du utfører kvalitativ og kvantitativ histologi-lignende analyse av hornhinnen stroma som tillater differensiering av sykdom fra normalt humant hornhinnevev.