Name: dried blood and serum spots as a useful tool for sample storage to evaluate cancer biomarkers
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00
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Nous tenons à remercier Gráinne Tierney pour aide à la rédaction.

Sérum et le sang périphérique ont été recueillies et stockées de donneurs sains et de patients qui ont donné le consentement éclairé pour participer à l’étude. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité d’éthique local conformément aux normes éthiques fixés dans la déclaration d’Helsinki de 1964.
1. sang entreposage à DBS
<ol><li>
Prélèvement d’échantillons de sang
	<ol>
<li>Collecter 3 mL d’échantillon de sang périphérique d...

<ol>
	<li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots.">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li><li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens.">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li><li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype+variability,+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola.">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li><li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots.">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li><li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda:+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure.">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li><li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns.">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).</li><li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2.">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li><li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., S&#248;rensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology.">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li><li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development?+The+question+of+the+vitamin+D+pathway.">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li><li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification.">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li><li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., R&#237;osZertuche, D., Z&#250;&#241;iga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+(IgG)+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings.">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li><li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples.">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li><li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification.">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).</li><li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry.">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li></ol>

Le présent protocole examine le potentiel pour le stockage de sérum et sang sur un papier filtre lorsque les laboratoires n’ont pas le personnel ou les infrastructures nécessaires pour la manipulation correcte des échantillons de sang. En particulier, le sang ou le sérum recueillis dans des tubes standards ou par piqûre doigt peut être stockée à l’aide de cette méthode et il n’y a pas besoin de congeler les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C immédiatement après le prélèvement de sang. DBS/DSS peut...

L’objectif principal de la recherche sur les biomarqueurs du cancer est l’identification de nouveaux paramètres biologiques qui peut être utilisé pour le diagnostic, pour prédire pronostic patient et pour déterminer si un patient va réagir à un traitement spécifique. Ce domaine de recherche est fondamental pour la découverte de traitements novateurs contre le cancer et joue un rôle clé dans le traitement sur mesure.
Les procédures effectuées au cours de chaque étape de l’identification de biomarqueurs et de validation doivent être fiables et reproductibles. Des pierres angulaires du succès de la recherche translationnelle sont le stockage correct des échantillons biologiques comme le sang et le sérum. Il s’agit de la première étape vers l’obtention de matériel biologique de qualité qui peut être utilisé pour effectuer des expériences de biologie moléculaire ou analyses de protéines.
Études multicentriques sont souvent nécessaires pour recruter suffisamment patients pour obtenir des données fiables. Pas tous les instituts sont en mesure de conserver les échantillons à-80 ° C ou à envoyer des échantillons d’autres centres internationaux en glace sèche. L’utilisation de papier filtre pour la collecte de sang est une méthode simple pour le stockage de sérum et sang et ne nécessite pas le gel immédiat des échantillons1,2. Une goutte de sang ou de sérum peut être repérée sur le papier, laissé sécher pendant la nuit et puis stocké pendant jusqu'à 14 jours à température ambiante1,2. Cela donne des chercheurs de temps pour envoyer les échantillons d’autres laboratoires. L’utilisation de sang séché taches (DBS) et taches séchées de sérum (DSS) pourraient ainsi simplifier la collaboration entre les instituts dans les pays développés et en développement.
Compte tenu de sa facilité d’utilisation, l’échantillonnage DBS est largement utilisé dans plusieurs types d’analyses pour des analyses sérologiques ou génétiques en aval. Par exemple, dans le passé, la DBS étaient fréquemment utilisés pour le VIH dans les pays en développement1,2,3,4,5. Un autre avantage de cette méthode de stockage est peuvent percevoir des échantillons de sang du doigt-pique, ce qui permet son utilisation pour le dépistage des essais 6,7,8. Exemple simple de manutention et de transport sont a d’autres avantages de DBS, surtout pour les échantillons prélevés dans les sites distants où il n’y a aucun équipement de laboratoire. Dans une publication précédente, nous avons utilisé DBS et DSS pour tester la vitamine D et vitamine D protéine de liaison (DBP) dans une série de patients caucasiens et africaine9. Nos collègues africains n’étaient pas en mesure d’obtenir de la glace sèche. Pour comparer les marqueurs biologiques pour comprendre les différences dans la voie de la vitamine D entre les deux populations ethniques, nous avons encore amélioré la procédure en utilisant des échantillons appariés, stockés dans des conditions normales et sur papier filtre. Après avoir optimisé la procédure DBS/DSS, nous avons pu analyser DBP et vitamine D dans le sérum de patients dans les deux cohortes. Nous avons également évalué un certain nombre de polymorphismes de nucléotides simples (SNP) après extraction de l’ADN du sang pour les personnes de race blanche et de DBS pour africains9. Le présent protocole permet des échantillons de sang de haute qualité doivent être conservés à température ambiante sans affecter les différents types d’analyses en aval allant de la biologie moléculaire aux tests ELISA. Il est recommandé pour une utilisation gérer les matières biologiques dans des études multicentriques ou pour les centres qui n’ont pas d’installations pour des conditions de stockage standard. Le protocole suivant représente l’aboutissement de ces procédures optimisées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk&#8206;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z761575</td>
			<td>Useful to store samples at room temperature for downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Serological Pipettes, 5 mL</td>
			<td>Stem cell</td>
			<td>#38003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-200 &#181;L tips</td>
			<td>Star-Lab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA microkit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td>This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>This is reported as Lysis Buffer 1 in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>This is reported as Lysis Buffer 2 in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp mini elute column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>This is reported as column in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1&#160; (included in QIAamp DNA microkit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2&#160; (included in QIAamp DNA microkit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>This is reported as Wash Buffer 2 in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DVDBP0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood and serum spots as a useful tool for sample storage to evaluate cancer biomarkers

Qualité d’échantillon de sang est essentielle pour assurer des analyses précises en aval comme la PCR en temps réel ou de ELISA. Un stockage correct des matériaux biologiques est le point de départ pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Tous les échantillons doivent être traités de la même manière de collecte de sang au stockage. Selon les analyses à effectuer, le sang et les échantillons de sérum doivent être conservées à-20 ° C ou à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Des échantillons de sérum sanguin/devraient également être aliquotés pour éviter les multiples de gel-dégel. Une autre question importante est les conditions de l’échantillon lors de l’expédition d’un laboratoire à l’autre. Si la glace sèche n’est pas disponible ou l’expédition prend plue que quelques jours, autres approches sont nécessaires. Une option consiste à utiliser le papier filtre pour la collecte de sang. Ici, nous proposons une méthode pour le sang et le prélèvement d’échantillons de sérum qui profite du sang séché (DBS) et séché de sérum (DSS). Nous avons développé la procédure pour extraire l’ADN de DBS pour l’évaluation en aval de quelques simples de nucléotide simple (SNP) par PCR en temps réel. Nous avons également optimisé un test ELISA à partir de protéines éluées de DSS. Cette méthode peut être utilisée avec d’autres tests ELISA ou les procédures d’évaluation des protéines.

Nous avons profité des DBS et DSS procédures pour stocker le sang et le sérum à la température ambiante sans affecter la qualité de la matière biologique. La figure 1 montre un exemple de l’épargnant de carte de protéines sans sang et après prélèvement sanguin. Afin de confirmer que le stockage sur un papier filtre et la procédure pour éluer sang n’interfèrent pas avec la qualité de l’échantillon, nous avons effectué une comparaison av...

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Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Ce protocole décrit une méthode simple et utile pour stocker le sang périphérique et le sérum/plasma pour des analyses en aval comme single nucleotide polymorphisme (SNP) évaluation et analyse d’ELISA.

Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

This method can help answer key questions in translational research such as the chance to study biomarkers in patients from developing countries. The main advantage of this technique is the possibility to store blood and serum samples for at least two weeks without freezing and provide high quality material for downstream analysis such as qPCR and ELISA. The implications of this technique extend toward diagnosis of diseases such as cancer and infectious diseases.This method can also be applied toward the diagnostic or research fields like the study of prenatal diseases or the analysis of infectious pathology such as HIV. We first had the idea for this method when we started comparing biomarkers between a Caucasian and an African case series for which frozen samples were not available. Visual demonstration of this method is critical as the blood spotting steps are difficult to learn.In this procedure, three milliliters of a blood sample is collected in a three milliliter tube with 5.4 milligrams of EDTA. Write the patient code number on the bottom right-hand corner of the saver card. Carefully re-suspend the blood with a five milliliter pipette.Next, pipette and transfer one spot of blood onto the saver card. Using a new tip for each blood aliquot, repeat the spotting to obtain a total of three to five blood spots. Leave the dried blood spots, or DBS, to dry overnight at room temperature with the cover of the saver card open in a horizontal position over an open, non-absorbent surface and avoiding direct sunlight.On the following day, store the card at room temperature in a plastic bag with desiccant until use. DNA will be extracted from three dried blood spots from the saver card. Begin by cutting each of the DBS from the card and separating them from the card.Cut the separated DBS into small pieces of about one millimeter in diameter. Place the small pieces from one DBS into a 1.5 milliliter centrifuge tube. To digest the samples, add to the tube 180 microliters of lysis buffer one from a commercially available DNA extraction kit, then add 20 microliters of proteinase K.Mix by vortexing.Place the tube in a thermo-incubator and incubate with shaking at 56 degrees celsius for 60 minutes. At the end of the incubation, briefly centrifuge the tube to remove drops from the lid. Start the wash by adding 200 microliters of lysis buffer two and vortexing for 10 seconds.Place the tube in a thermo-mixer and incubate at 70 degrees celsius for 10 minutes. Place the elusion column in a new two milliliter collection tube and discard the old one. Add 500 microliters of wash buffer and centrifuge at 6000 times gravity for one minute.Place the column in a new two milliliter collection tube and discard the old one. Add 500 microliters of wash buffer two and centrifuge at 6000 times gravity for one minute. Place the column in a new two milliliter collection tube and discard the old one.Centrifuge at 20, 000 times gravity for three minutes to dry the membrane. To elute the DNA, place the column in a new 1.5 milliliter centrifuge tube and discard the collection tube. Place 50 microliters of distilled water onto the center of the membrane and incubate at room temperature for 10 minutes.Centrifuge the tube at 20, 000 times gravity for one minute. Collection the elute and place again on the center of the membrane. Centrifuge the tube again at 20, 000 times gravity for one minute.Discard the membrane. After measuring the DNA concentration using a spectrophotometer, store the DNA at minus 20 degrees celsius until use. For this procedure, seven milliliters of peripheral blood sample is first collected in a seven milliliter tube without EDTA.Leave the blood sample to coagulate at room temperature for 30 minutes. Write the patient code number on the bottom right-hand corner of the saver card. Centrifuge the blood sample at 1100 times gravity at room temperature for 15 minutes.Remove the supernatant from the tube and transfer it to a new 15 milliliter tube. Carefully re-suspend the blood with a five milliliter pipette. Pipette and transfer one spot of serum onto the saver card.Repeat the spotting to have a total of three to five blood spots. Leave the dried sero spots to dry overnight at room temperature with the cover of the saver card open. On the following day, store the card at room temperature in a plastic bag with desiccant until use.If storage is longer than 14 days, store at minus 20 degrees celsius. Prepare for the ELISA assay by thawing the DSS for each sample if necessary. To elute the protein from the DSS, cut one DSS into small pieces of about one millimeter in diameter and put the pieces in a 1.5 milliliter tube.Then, add four microliters of PBS. Shake the samples at low speed at four degrees celsius overnight. On the following day, use an appropriate dilution of the protein elute as a serum sample for secreted protein or growth factor analysis using a commercially available kit.In this protocol, blood and serum samples were stored as dried spots on filter paper at room temperature. A representative protein saver card is shown before and after blood sampling. In order to confirm that the storage on filter paper and the procedure to elute blood do not interfere with the sample quality, ELISA assays for vitamin D binding protein, or DBP levels, were performed on eight samples of serum collected in a two milliliter tube and stored immediately at minus 80 degrees celsius or collected as dried serum spots.The coefficient of variation, or CV, between matched samples ranged from 2%to 24%and the mean CV was 9.6%Once mastered, this technique can be done in 10, 15 minutes if it is performed properly. Following this procedure, downstream methods of molecular biology or protein analysis can be performed. After its development, this technique enables research in the field of translational research and biomarker analysis to collaborate with institutes from all over the world that do not have the lab equipment to store biological samples in standard conditions.After watching this video, you should have a good understanding of how to correctly store blood samples in dried blood and serum spots. Don't forget that working with blood and chemical reagent can be extremely hazardous and precautions such as wearing gloves and a lab coat should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modèle de souris de la fatigue induite par périphérique Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Une procédure exhaustive pour évaluer la<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance du Cancer nanomédicaments

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

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Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

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mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

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