Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها كريستوفر ودانا ريف مؤسسة الدولية اتحاد البحوث المتعلقة بإصابات النخاع الشوكي، ميريام الدكتور وشيلدون زاي اديلسون مؤسسة البحوث الطبية، مؤسسة جبب، معهد البحوث الأساسية نوفارتيس، الحصول على مساهمات سخية من فنسنت وكوتس ستيلا، ومؤسسة أبحاث السرطان رونيون ديمون (DRG-2125-12).

جميع الإجراءات التي تنطوي على القوارض تتفق مع المبادئ التوجيهية لجامعة ستانفورد، التي تمتثل للسياسات الوطنية وقوانين الدولة و. وافق جميع الإجراءات الحيوان "الفريق الإداري" في جامعة ستانفورد في "مختبر رعاية الحيوان".
ملاحظة: ترد جميع التراكيب الحل والمخزن المؤقت في الج?...

     

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

لأنه بمثابة microglia الخلايا المناعية الحارس من الجهاز العصبي المركزي، فتستجيب للغاية للتغييرات البيئية؛ ولذلك، مطلوب قدر كبير من العناية لتقليل الاستجابات التحريضية داخل الخلايا أثناء عزلتها والثقافة8. ويتم ذلك في هذا البروتوكول من خلال السرعة ودرجة الحرارة. حفظ الخلايا على ?...

الضامة حمة الجهاز العصبي المركزي، microglia التفاعل مع مجموعة واسعة من الدوائر العصبية والشبكات مما يشير إلى الدبقية. أنها تلعب دوراً حيويا في التنمية والتوازن في الدماغ من خلال تشذيب متشابك وإزالة الخلايا أبوبتوتيك وتفاعلات عابرة مع العمليات العصبية1،2. Microglia هم أوائل المستجيبين للإصابات العصبية، توسيع نطاق عملياتها طويلة ورقيقة إلى مواقع الآفة لتنسيق الاستجابات التحريضية وتحد من النزيف3،4. التغييرات في مورفولوجيا microglial ووظيفتها في كل مكان في إصابات الجهاز العصبي المركزي الحادة والمزمنة، ومعرض microglia تتغير مورفولوجيا، والترجمة، والتعبير عن وسطاء التهابات في مجموعة متنوعة من الأمراض الدول1. وتشير الدراسات الجينية البشرية إلى أن الطفرات التي تغير من خطر الإصابة بأمراض الأعصاب وكثيراً ما يغلب أو حصرا يعرب عنها ميكروجليا في الجهاز العصبي المركزي سليمة، مشيراً إلى دور حاسم ل microglia في إمراضية المرض أو التقدم5 . ونظرا لشهرتهم في الإصابة والمرض، الفهم للبيولوجيا ميكروجليال أولوية عالية لتطوير النهج العلاجية الجديدة.
نشأت العديد من التطورات الهامة لفهم علم الأحياء ميكروجليال باستقراء التقنيات والآليات التي اكتشفت في الدراسات المتعلقة بالسكان بلعم الأخرى بما في ذلك تعريفات وظيفية وملامح التعبير الجيني وأساليب الثقافة /المورفولوجية الدول. على الرغم من أن تعميم بلعم وظائف غالباً ما تلعب بها بطرق مفاجئة داخل المشهد الجهاز العصبي المركزي، ميكروجليا هم أنفسهم درجة عالية من التخصص، نستعرض مورفولوجيا متشعب وتوقيع تعبير جينات فريدة أن مجموعات منهم إلى جانب غيرها من النسيج الضامة6. وقد Microglia نسب التي تختلف عن معظم الأنسجة الضامة؛ أنها استعمار في الجهاز العصبي المركزي خلال موجه جنينية مبكرة من هيماتوبويسيس البدائية وتجديد ذاتيا في جميع مراحل الحياة، مستقلة عن مساهمات نهائية هيماتوبويسيس7. توقيع التعبير الجيني ناضجة تماما من microglia الكبار لا يتحقق حتى بعد الولادة في الأسبوع الثاني8. منبهات البيئية من الأنسجة المحيطة دوراً رئيسيا في إملاء بلعم الأنسجة الخاصة ميزات6، التي تشمل التعرض المحدود لعوامل المنقولة بالدم الممنوحة من حاجز الدم في الدماغ9في الجهاز العصبي المركزي.
وهي عقبة واحدة لفهم كامل الاشتراكات ميكروجليال للتوازن في الجهاز العصبي المركزي والمرض صعوبة لخص الخصائص المتخصصة من microglia ناضجة ينظر في فيفو مع الخلايا المنقي في المختبر. تم تطوير العديد من الأساليب لعزل والثقافة microglia سليمة، ولكن معظم النهج المتبعة تعتمد على مصل لدعم بقاء الخلية. وقد أظهرنا أن إضافة مصل الدم، الذي هو طبيعته متغير كاشف التي تحتوي على مجموعة واسعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا، وهي إشكالية بصفة خاصة عند العمل مع ميكروجليا لأنه يشجع مورفولوجيا أميبية، زاد انتشار، و غالباً ما ينظر البلعمه زيادة9 في فيفو عندما يتعرض microglia الدم تتحمل العوامل بعد تعطل حاجز الدم في الدماغ. بهذه المقاييس، تشبه الخلايا المعرضة للمصل microglia في الإصابة أو المرض الدول، ولكن خفضت هذه التعديلات عندما تستزرع microglia في المتوسطة النمو المحددة التي تحتوي على السائل الدماغي النخاعي-1 (أو إيل-34)، TGF-β، ونسبة الكولسترول في الدم، وسيلينيت.
يوفر هذا البروتوكول التفاصيل لاستزراع microglia الفئران الأحداث تحت ظروف خالية من المصل، المتصلة بالأعمال المنشورة مؤخرا9. هذا البروتوكول قد تم تبسيطها للفئران من يوم الولادة 21-30 (P21-P30)، ولكن يمكن تكييفها لعزل ميكروجليا من الفئران والجرذان في أي عمر، على الرغم من أن العائد والجدوى الشاملة سوف تختلف باختلاف الأنواع وسن الحيوان. الأعلى غلة وبقاء الأمثل يتحقق عند استخدام microglia قليلاً غير ناضجة (~ P9)، والغلات وجدوى مستدق تدريجيا إلى حد ما انخفاض مستويات في الحيوانات الكبار. ميكروجليا يمكن أيضا أن تكون معزولة من الفئران، ولكن وجدنا أن خلايا الفئران إظهار أعلى بكثير الغلات والجدوى، وتعقيد مورفولوجيس متشعب، عند مقارنتها بالماوس الخلايا في ثقافات خالية من المصل. الحيوانات أعمارهم أكبر من P50 لم يتم تقييمها مع هذا البروتوكول. وقد تم تحسين هذا الإجراء العزلة إيمونوبانينج لتقليل التغيرات في microglial النسخي التشكيلات الجانبية أثناء العزلة وإلى أقصى حد ممكن بقاء المتلقين للمعلومات من الخلايا. باستخدام هذه التقنيات والصياغات وسائل الإعلام، يمكن أن يستمر الثقافات العالية الجدوى الأولية لمدة أسابيع. يحمل مورفولوجيا متشعب جداً التي تنطوي على التوسع السريع وتراجع عمليات Microglia مثقف في ظل هذه الظروف ومعدلات انتشار منخفضة نسبيا. نحن تسليط الضوء على أهمية المصل-التعرض على هذه الخصائص، ومناقشة مواطن القوة والضعف لهذه الطريقة بالنسبة للطرق الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat: Sprague-Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Cat# 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# MCA275R</td>
			<td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polycolonal anti-Iba1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# AB5076</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Ki67&#160;</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Cat# AB15580</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11055</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-21203</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-31573</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 28313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td>Galen Laboratory Supplies</td>
			<td>Cat# GAG-HS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# M3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from milk solids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# P6838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 100-35B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat# 5195-ML/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>Cat# 700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 354233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 90260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 20606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# DPRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat# 17-5445-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 21041-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Cat# 0100-20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat# 62406-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:25,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid/Gondoic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 50 &#956;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Douncing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 200 &#956;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panning Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglia Growth Medium (MGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &#956;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &#956;g/mL insulin, 100 &#956;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite 
			Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV Coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing 2 &#956;g/mL collagen IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Seperation Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &#956;L 1 M CaCl2, 5 &#956;L 1 M MgCl2 
			Comments: Mix well after the addition of&#160; CaCl2 and MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &#956;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &#956;g/mL heparan sulfate, 0.1 &#956;g/ml oleic acid, and 0.001 &#956;g/ml gondoic acid 
			Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &#176;C and do not add more than 1.5 &#956;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Microglia تمثل 5-10% من جميع خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) وهي تزداد لفت الانتباه نظراً لمساهماتها خلال التنمية، والتوازن، والمرض. على الرغم من أن قد درست بالتفصيل الضامة لعقود، وميزات متخصصة من microglia، الضامة المقيم في الأنسجة من الجهاز العصبي المركزي، فقد ظلت غامضة إلى حد كبير، جزئيا بسبب أوجه القصور في القدرة على تلخيص microglial ناضجة خصائص في الثقافة. نحن هنا، لتوضيح إجراءات واضحة لعزل السريع microglia نقية من الدماغ القوارض ناضجة. كما يصف لنا ثقافة خالية من المصل الظروف التي تدعم مستويات عالية من السلامة ميكروجليال على مر الزمن. معرض Microglia المزروعة تحت هذه الشروط المعرفة المتوسطة وضع العمليات متشعب ومراقبة ديناميكية السلوك. علينا توضيح بعض آثار التعرض للمصل على microglia مثقف ومناقشة كيف يمكن مقارنة هذه الثقافات خالية من المصل لكل الثقافات المعرضة للمصل، فضلا عن microglia فيفو.

ويصف هذا البروتوكول أسلوب إلى ثقافة عالية النقاء تتفرع microglia من الفئران الأحداث. نتائج مماثلة يمكن الحصول عليها باستخدام الحيوانات غير ناضجة، والفترة المحيطة بالولادة، والكبار، كما هو مبين أدناه. إذ غالباً ما تتضمن الخلية العزلة المفروضة الفروق الدقيقة والعديد من الفر?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

قد أعيقت الجهود المبذولة لفهم الدالة ميكروجليال بالتفصيل بعدم وجود نماذج الثقافة ميكروجليال أن الخص خصائص ناضجة في فيفو microglia. ويصف هذا البروتوكول نهج العزلة والثقافة تهدف إلى المحافظة على بقاء قوية من microglia الفئران الناضجة متشعب جداً في ظل الظروف المحددة والمتوسطة.

العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

The overall goal of this cell culture protocol is to generate highly pure cultures of microglia from developing or adult rodents that can be maintained without exposure to serum. This procedure can help answer key questions in neuroscience related to microglia morphology, fibrous ketosis, and microglia's interaction with other CNS cell types. The main advantage to this protocol is that microglia can be rapidly isolated from rodent tissue of any age and cultured without exposure to serum.To remove the brain, cut the occipital condyle from the spinal cord of an animal on both sides with dissection scissors, being careful not to damage the brain. Then, cut skin along the top of the skull, and cut up one side along the parietal and frontal bone towards the nasal bone. Carefully pull back the top of the skull with forceps, quickly remove the brain, and place it into prechilled DPBS on ice.Repeat the procedure for all remaining animals. After the brains have been collected in cold DPBS, chop each brain into one cube millimeter chunks in a petri dish on ice with a cold scalpel blade and transfer to an ice cold dounce homogenizer with five to seven milliliters of ice cold douncing buffer. Next, use a loose fitting dounce homogenizer to dissociate the tissue with 10 to 20 gentle and incomplete strokes.Take care not to directly crush the tissue at the bottom of the homogenizer. Instead, impel the tissue through the space between the sides of the piston and the homogenizer. It is important to slowly homogenize the tissue with multiple rounds of douncing to preserve microglia viability.Afterward, carefully remove the piston to prevent introducing air bubbles. Allow poorly dissociated tissue chunks to settle to the bottom of the homogenizer and transfer the supernatant to a new, chilled, 50 milliliter conical tube. Subsequently, replace the removed volume with fresh douncing buffer and repeat the dissociation procedure for a total of three to four rounds, or until all tissue has been dissociated.In this procedure, add ice cold douncing buffer to the 50 milliliter conical tube containing the cell suspension and adjust the total volume to 33.5 milliliters. Next, add 10 milliliters of MSB to the cell suspension and mix thoroughly by inverting the tube several times. This will result in a 23%final concentration of MSB in a volume of 43.5 milliliters.After that, centrifuge the cells for 15 minutes at 500 x g at 4 degrees Celsius with slow braking. Then, remove the top layer of myelin and debris and the supernatant with a pipette. Take care when removing the top layer to ensure as much of it is removed as possible.Following that, resuspend the cell pellet in 12 milliliters of panning buffer. Gently triturate the cell suspension to break up any remaining clumps of cells. In this step, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer to remove large debris or cell clumps.Rinse the OX42 coated panning dish three times with DPBS. Don't allow the plate to completely dry between washes. Pour off the last DPBS wash and apply the filtered cell suspension to the panning dish.Gently swirl the plate to distribute the cells. Then, incubate the plate on a flat surface at room temperature for 20 minutes to allow cells to adhere. Do not incubate longer than 20 minutes or cells will become very difficult to recover from the dish.Afterward, rinse the panning dish with DPBS 10 times to remove nonadherent cells. Microglia will be firmly attached to the plate, so swirl the plate with each rinse to ensure the removal of other nonadherent cells. Pour off the last DPBS wash and replace with 15 milliliters of DPBS and 200 microliters of trypsin.To trypsinize the cells, incubate the dish for less than or equal to 10 minutes at 37 degrees Celsius. After 10 minutes of trypsinization, microglia will still be stuck to the plate. Pour off the mixture and gently wash the plate two times with DPBS to remove the trypsin.Then, replace with 12 milliliters of ice cold MGM. Subsequently, place the panning dish on ice for two minutes to help weaken cell and substrate interaction and make sure that the dish is flat to prevent areas of the panning dish from drying out. After that, pipette vigorously with a 10 milliliter pipette and pipette controller on high speed to recover cells from the panning dish.Draw a 16 by 16 grid with the stream of liquid from the pipette to try and remove all of the cells. It is important to find a balance between overall cell recovery and the health of your culture. Repeated pipetting of the cell supernatant against the panning dish will result in reduced viability of your culture.Check the cells under a microscope at 20x magnification to make sure that they have detached from the plate. Mark the spots on top of the dish where cells are stuck and repeat pipetting in those areas. Collect the cell suspension and allocate three to four milliliters of supernatant in each 15 milliliter conical tube.Spin it for 15 minutes at 500 x g at four degrees Celsius with slow braking. After 15 minutes, aspirate the supernatant, leaving 0.5 milliliters of MGM with the cell pellet. Then, resuspend each pellet in remaining MGM and pull the cells from all the tubes.Following that, count the cells with a hemocytometer. Now, plate 15 microliters of collagen IV coating directly in the center of a 24 well anionic cationic coated tissue culture plate and incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius. After counting the cells with a hemocytometer, dilute them to 2.3 x 10 to the five per milliliter in MGM.Aspirate collagen IV spot and immediately plate 15 microliters of cell suspension to this spot to yield 3.5 x 10 to the three cells per spot. Next, incubate for five to ten minutes at 37 degrees Celsius to allow the cells to adhere. Then, gently add 500 microliters of CO2 equilibrated TIC to the well.If plating on cover slips, first coat the sterile glass cover slips with 10 micrograms per milliliter PDL in water for one hour at room temperature. Then, wash them three times with water and let them dry in a hood under UV light before proceeding with spot plating on the cover slips. In order to demonstrate successful isolation and culture of highly pure microglia, we isolated microglia from P21 rats and cultured these cells in TIC or TIC supplemented with 10%FCS for eight days.Cells were then fixed and stained with microglial markers and proliferation markers. Cells cultured in TIC show a ramified morphology, low levels of proliferation, and expression of microglia markers. In comparison, cells cultured in TIC supplemented with 10%FCS also stained for microglial markers, but show high levels of proliferation and amoeboid morphology, properties often seen in activated microglia.In addition to staining for cell markers, RNA-Seq on freshly isolated cells can provide a powerful and sensitive tool for evaluating the RNA profile of the cells and can help inform the starting purity of cultures. CD11b micropanning typically results in a small percentage of CD11b positive neutrophils and monocyte carryover, in addition to CD11b positive microglia. These cells will die in TIC after a few days, but can complicate analysis of earlier timepoints.Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after 14 DIV in TIC. After two weeks, serum free cultures show dynamic surveillance behavior with rapid process extensions and retractions throughout the dish. Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after five DIV in TIC before and after exposure to fetal calf serum.A rapid morphological change is evident after serum exposure. Once mastered, this protocol can be done in four to five hours, if performed properly. Following this procedure, other assays to monitor phagocytosis, chemotaxis, survival, cytokine release, transcriptional responses to stimuli, can be performed in order to answer additional questions about microglia function.After watching this video, you should have a good understanding on how to rapidly isolate microglia from adult rodent tissue and culture them under serum free conditions.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

الآلي Sholl تحليل الصرف متعلق بالخلايا العصبية رقمية على مستويات متعددة

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

ديناميكية الكمية الحسية اختبار لوصف المعالجة المركزية الألم

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

الخلايا الدبقية الصغيرة بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي الأب البديل لتحديد الجسيمات النانوية العصبية

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

التحديد الكمي مورفولوجية Microglia من Photomicrographs Immunohistochemistry استعداد النسيج باستخدام إيماجيج

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

جيل من Oligodendrocytes وOligodendrocyte- متوسطة مكيفة للتجارب الثقافة المشتركة

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...