Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Christopher und Dana Reeve Foundation International Research Consortium auf Verletzungen des Rückenmarks, Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, der Stiftung JPB Novartis Institute der Grundlagenforschung unterstützt, großzügige Beiträge von Vincent und Stella Coates und Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Alle Verfahren, die Nagetiere entsprach Stanford University Richtlinien, welche nationalen und staatlichen Gesetze und Richtlinien einhalten. Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care stimmten alle tierische Verfahren.
Hinweis: Alle Lösung und Puffer Kompositionen sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt.
1. bereiten Sie eine Petrischale für CD11b Immunopanning (Tag 0)
Hinweis: Ber...

     

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Da Mikroglia als Sentinel immunen Zellen des ZNS dienen, sind sie sehr ansprechend auf Veränderungen der Umwelt; Daher ist großer Sorgfalt erforderlich, um entzündliche Reaktionen in den Zellen während ihrer Isolation und Kultur8zu minimieren. Dies geschieht in diesem Protokoll durch Geschwindigkeit und Temperatur. Die Zellen auf Eis oder bei 4 ° C zu halten, wann immer möglich Aktivierung, reduziert so dass alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C erfolgen, die Tiere sind mit eiskalten P...

Als Makrophagen CNS Parenchym Mikroglia interagieren mit einer Vielzahl von neuronalen Schaltkreise und Glia Signalisierung Netzwerke. Sie spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Homöostase des Gehirns durch synaptische Rebschnitt, apoptotische Zelle Abfertigung und transiente Interaktionen mit neuronalen Prozessen1,2. Mikroglia sind frühe Responder zu neurologischen Verletzungen, erweitern ihre langen, dünnen Prozesse Läsionsorte zu Entzündungsreaktionen zu koordinieren und Blutungen3,4zu begrenzen. Veränderungen in der Mikroglia Morphologie und Funktion sind allgegenwärtig in akuten und chronischen Verletzungen der CNS und Mikroglia Ausstellung verändert, Morphologie, Lokalisierung und Ausdruck von Entzündungsmediatoren in einem breiten Spektrum von Krankheit Staaten1. Menschliche genetische Studien zeigen, dass Mutationen, die Gefahr für Neurodegenerative Erkrankungen verändern oft überwiegend oder ausschließlich von Mikroglia im intakten ZNS, Hinweis auf eine entscheidende Rolle für die Mikroglia in der Pathogenese der Krankheit oder das Fortschreiten5 ausgedrückt werden . Da ihre Prominenz bei Verletzungen und Krankheit, ist fördern das Verständnis der Mikroglia Biologie einen hohen Stellenwert für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.
Viele wichtige Fortschritte für das Verständnis der Mikroglia Biologie entstanden durch Extrapolation Techniken und Mechanismen, die in Studien von anderen Makrophagen Populationen einschließlich Kulturmethoden, gen Expressionsprofile und Definition der funktionalen entdeckt / morphologischen Staaten. Obwohl generalisiert Makrophagen Funktionen oft auf überraschende Weise in der CNS-Landschaft spielen, Mikroglia selbst sind hochspezialisiert, ausstellenden eine verzweigte Morphologie und eine einzigartige gen Ausdruck Signatur, die sie von anderem Gewebe unterscheidet Makrophagen-6. Mikroglia haben eine Linie, die sich von den meisten anderen Gewebe Makrophagen unterscheidet; Sie besiedeln die CNS während einer frühen embryonalen Welle der primitiven Hämatopoese und selbst im gesamten Leben, unabhängig von der definitiven Hämatopoese7Beiträge zu erneuern. Die vollreifen gen Ausdruck Unterschrift des Erwachsenen Mikroglia wird nicht bis die zweite postnatalen Woche8erreicht. Ökologische Hinweise aus dem umliegenden Gewebe Rolle diktieren gewebespezifischen Makrophagen Funktionen6, die im ZNS beschränkt Belastung durch Blut übertragbare Faktoren gewährt durch die Blut - Hirn-Schranke9beinhaltet eine wichtige.
Ein Hindernis für die Mikroglia Beiträge zu CNS-Homöostase und Krankheit vollständig zu verstehen ist die Schwierigkeit, die speziellen Eigenschaften der Reifen Mikroglia gesehen in Vivo mit gereinigten Zellen Rekapitulation in-vitro-. Viele Methoden wurden entwickelt, um zu isolieren und Kultur intakt Mikroglia, aber die meisten Ansätze setzen auf Serum, Überleben der Zellen zu unterstützen. Wir haben gezeigt, dass die Zugabe von Serum, das ist ein von Natur aus Variable Reagenz enthält eine breite Palette von bioaktiven Moleküle, ist besonders problematisch, wenn arbeiten mit Mikroglia weil es eine amöboiden Morphologie fördert Verbreitung erhöht, und erhöhte Phagozytose9 oft gesehen in Vivo bei Mikroglia blutübertragbaren Faktoren nach der Unterbrechung der Blut - Hirn-Schranke ausgesetzt sind. Durch diese Metrik Serum-exponierten Zellen Microglia Verletzungen oder Krankheiten ähneln, aber derartige Veränderungen reduziert wenn Mikroglia in definierten Wachstumsmedium mit CSF-1 (oder IL-34), TGF-β, Cholesterin und Selenit kultiviert werden.
Dieses Protokoll enthält Details zur Kultivierung juvenile Ratte Mikroglia unter serumfreien Bedingungen im Zusammenhang mit kürzlich veröffentlichtes Werk9. Dieses Protokoll wurde für Ratten von postnatale Tag 21-30 (P21 - P30) gestrafft, aber an Microglia von Ratten und Mäusen jeden Alters isolieren angepasst werden kann, obwohl der Ertrag und die gesamte Tragfähigkeit abhängig von der Art und dem Alter des Tieres variiert. Maximale Erträge und optimale Rentabilität ist erreicht, wenn etwas unreif Mikroglia verwenden (~ P9), mit Erträgen und Lebensfähigkeit allmählich verjüngt sich zu etwas niedrigere Ebenen bei erwachsenen Tieren. Mikroglia kann auch von Mäusen isoliert sein, aber wir haben festgestellt, dass die Rattenzellen deutlich höhere Erträge, Rentabilität und Komplexität der verzweigten Morphologien, zeigen im Vergleich zu Mauszellen in serumfreien Kulturen. Tiere im Alter von mehr als P50 mit diesem Protokoll nicht ausgewertet wurden. Dieses Immunopanning-Isolierung-Verfahren wurde optimiert, um Veränderungen der Mikroglia transcriptional Profile bei Isolierung zu minimieren und nachgelagerten Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Mit diesen Techniken und Medien Formulierungen, können hohe Rentabilität Primärkulturen wochenlang aufrecht erhalten werden. Unter diesen Bedingungen kultiviert Mikroglia weisen eine stark verzweigte Morphologie mit schnellen ein- und Ausfahren der Prozesse und relativ niedrige Rate der Verbreitung. Wir unterstreichen die Bedeutung der Serum-Exposition auf diese Eigenschaften und stärken und Schwächen dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen zu diskutieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat: Sprague-Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Cat# 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# MCA275R</td>
			<td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polycolonal anti-Iba1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# AB5076</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Ki67&#160;</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Cat# AB15580</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11055</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-21203</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-31573</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 28313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td>Galen Laboratory Supplies</td>
			<td>Cat# GAG-HS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# M3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from milk solids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# P6838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 100-35B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat# 5195-ML/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>Cat# 700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 354233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 90260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 20606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# DPRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat# 17-5445-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 21041-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Cat# 0100-20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat# 62406-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:25,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid/Gondoic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 50 &#956;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Douncing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 200 &#956;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panning Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglia Growth Medium (MGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &#956;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &#956;g/mL insulin, 100 &#956;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite 
			Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV Coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing 2 &#956;g/mL collagen IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Seperation Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &#956;L 1 M CaCl2, 5 &#956;L 1 M MgCl2 
			Comments: Mix well after the addition of&#160; CaCl2 and MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &#956;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &#956;g/mL heparan sulfate, 0.1 &#956;g/ml oleic acid, and 0.001 &#956;g/ml gondoic acid 
			Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &#176;C and do not add more than 1.5 &#956;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Mikroglia repräsentieren ca. 5-10 % aller Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) und sind immer mehr Aufmerksamkeit durch ihre Beiträge während der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Obwohl Makrophagen im Detail für Jahrzehnte, spezielle Funktionen der Mikroglia, die Gewebe-Bewohner Makrophagen des ZNS untersucht wurden, blieben weitgehend geheimnisvoll, teilweise aufgrund von Einschränkungen in der Fähigkeit, Reife Mikroglia rekapitulieren Unterkünfte in Kultur. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die schnelle Lokalisierung der reinen Mikroglia aus dem Reifen Nagetier Gehirn. Wir beschreiben auch serumfreien Kulturbedingungen, die hohe Rentabilität der Mikroglia im Laufe der Zeit unterstützen. Mikroglia, die unter diesen Bedingungen definiert-Medium kultiviert weisen aufwändige verzweigte Prozesse und dynamische Überwachung Verhalten. Wir veranschaulichen einige Auswirkungen der Serum-Exposition auf kultivierten Mikroglia und besprechen, wie diese serumfreien Kulturen im Vergleich zu Serum-exponierten Kulturen sowie Mikroglia in Vivo.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultur hochreine verzweigt Mikroglia von jungen Ratten. Ähnliche Ergebnisse können mit unreifen, perinatale und Erwachsene Tiere, wie weiter unten besprochen. Da Zelle Isolationen oft beinhalten subtilen Nuancen und viele Möglichkeiten für Zellen sterben verwendet wir Qualitätskontrolle Kontrollpunkte um Erfolg in verschiedenen Schritten zu ermitteln. Wir überwacht in der Regel Zellsuspensionen mit einer Hemocytometer in mehreren Schritte...

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Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

The overall goal of this cell culture protocol is to generate highly pure cultures of microglia from developing or adult rodents that can be maintained without exposure to serum. This procedure can help answer key questions in neuroscience related to microglia morphology, fibrous ketosis, and microglia's interaction with other CNS cell types. The main advantage to this protocol is that microglia can be rapidly isolated from rodent tissue of any age and cultured without exposure to serum.To remove the brain, cut the occipital condyle from the spinal cord of an animal on both sides with dissection scissors, being careful not to damage the brain. Then, cut skin along the top of the skull, and cut up one side along the parietal and frontal bone towards the nasal bone. Carefully pull back the top of the skull with forceps, quickly remove the brain, and place it into prechilled DPBS on ice.Repeat the procedure for all remaining animals. After the brains have been collected in cold DPBS, chop each brain into one cube millimeter chunks in a petri dish on ice with a cold scalpel blade and transfer to an ice cold dounce homogenizer with five to seven milliliters of ice cold douncing buffer. Next, use a loose fitting dounce homogenizer to dissociate the tissue with 10 to 20 gentle and incomplete strokes.Take care not to directly crush the tissue at the bottom of the homogenizer. Instead, impel the tissue through the space between the sides of the piston and the homogenizer. It is important to slowly homogenize the tissue with multiple rounds of douncing to preserve microglia viability.Afterward, carefully remove the piston to prevent introducing air bubbles. Allow poorly dissociated tissue chunks to settle to the bottom of the homogenizer and transfer the supernatant to a new, chilled, 50 milliliter conical tube. Subsequently, replace the removed volume with fresh douncing buffer and repeat the dissociation procedure for a total of three to four rounds, or until all tissue has been dissociated.In this procedure, add ice cold douncing buffer to the 50 milliliter conical tube containing the cell suspension and adjust the total volume to 33.5 milliliters. Next, add 10 milliliters of MSB to the cell suspension and mix thoroughly by inverting the tube several times. This will result in a 23%final concentration of MSB in a volume of 43.5 milliliters.After that, centrifuge the cells for 15 minutes at 500 x g at 4 degrees Celsius with slow braking. Then, remove the top layer of myelin and debris and the supernatant with a pipette. Take care when removing the top layer to ensure as much of it is removed as possible.Following that, resuspend the cell pellet in 12 milliliters of panning buffer. Gently triturate the cell suspension to break up any remaining clumps of cells. In this step, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer to remove large debris or cell clumps.Rinse the OX42 coated panning dish three times with DPBS. Don't allow the plate to completely dry between washes. Pour off the last DPBS wash and apply the filtered cell suspension to the panning dish.Gently swirl the plate to distribute the cells. Then, incubate the plate on a flat surface at room temperature for 20 minutes to allow cells to adhere. Do not incubate longer than 20 minutes or cells will become very difficult to recover from the dish.Afterward, rinse the panning dish with DPBS 10 times to remove nonadherent cells. Microglia will be firmly attached to the plate, so swirl the plate with each rinse to ensure the removal of other nonadherent cells. Pour off the last DPBS wash and replace with 15 milliliters of DPBS and 200 microliters of trypsin.To trypsinize the cells, incubate the dish for less than or equal to 10 minutes at 37 degrees Celsius. After 10 minutes of trypsinization, microglia will still be stuck to the plate. Pour off the mixture and gently wash the plate two times with DPBS to remove the trypsin.Then, replace with 12 milliliters of ice cold MGM. Subsequently, place the panning dish on ice for two minutes to help weaken cell and substrate interaction and make sure that the dish is flat to prevent areas of the panning dish from drying out. After that, pipette vigorously with a 10 milliliter pipette and pipette controller on high speed to recover cells from the panning dish.Draw a 16 by 16 grid with the stream of liquid from the pipette to try and remove all of the cells. It is important to find a balance between overall cell recovery and the health of your culture. Repeated pipetting of the cell supernatant against the panning dish will result in reduced viability of your culture.Check the cells under a microscope at 20x magnification to make sure that they have detached from the plate. Mark the spots on top of the dish where cells are stuck and repeat pipetting in those areas. Collect the cell suspension and allocate three to four milliliters of supernatant in each 15 milliliter conical tube.Spin it for 15 minutes at 500 x g at four degrees Celsius with slow braking. After 15 minutes, aspirate the supernatant, leaving 0.5 milliliters of MGM with the cell pellet. Then, resuspend each pellet in remaining MGM and pull the cells from all the tubes.Following that, count the cells with a hemocytometer. Now, plate 15 microliters of collagen IV coating directly in the center of a 24 well anionic cationic coated tissue culture plate and incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius. After counting the cells with a hemocytometer, dilute them to 2.3 x 10 to the five per milliliter in MGM.Aspirate collagen IV spot and immediately plate 15 microliters of cell suspension to this spot to yield 3.5 x 10 to the three cells per spot. Next, incubate for five to ten minutes at 37 degrees Celsius to allow the cells to adhere. Then, gently add 500 microliters of CO2 equilibrated TIC to the well.If plating on cover slips, first coat the sterile glass cover slips with 10 micrograms per milliliter PDL in water for one hour at room temperature. Then, wash them three times with water and let them dry in a hood under UV light before proceeding with spot plating on the cover slips. In order to demonstrate successful isolation and culture of highly pure microglia, we isolated microglia from P21 rats and cultured these cells in TIC or TIC supplemented with 10%FCS for eight days.Cells were then fixed and stained with microglial markers and proliferation markers. Cells cultured in TIC show a ramified morphology, low levels of proliferation, and expression of microglia markers. In comparison, cells cultured in TIC supplemented with 10%FCS also stained for microglial markers, but show high levels of proliferation and amoeboid morphology, properties often seen in activated microglia.In addition to staining for cell markers, RNA-Seq on freshly isolated cells can provide a powerful and sensitive tool for evaluating the RNA profile of the cells and can help inform the starting purity of cultures. CD11b micropanning typically results in a small percentage of CD11b positive neutrophils and monocyte carryover, in addition to CD11b positive microglia. These cells will die in TIC after a few days, but can complicate analysis of earlier timepoints.Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after 14 DIV in TIC. After two weeks, serum free cultures show dynamic surveillance behavior with rapid process extensions and retractions throughout the dish. Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after five DIV in TIC before and after exposure to fetal calf serum.A rapid morphological change is evident after serum exposure. Once mastered, this protocol can be done in four to five hours, if performed properly. Following this procedure, other assays to monitor phagocytosis, chemotaxis, survival, cytokine release, transcriptional responses to stimuli, can be performed in order to answer additional questions about microglia function.After watching this video, you should have a good understanding on how to rapidly isolate microglia from adult rodent tissue and culture them under serum free conditions.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Dynamische Quantitative Sensory Testing zu Charakterisieren zentralen Schmerzverarbeitung

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...