Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

이 작품은 크리스토퍼와 다 나 리브 재단 국제 연구 컨소시엄 셀던 G. 샌즈 의료 연구 재단, JPB 재단, 노바 티 스 연구소의 기본 연구, 척수 부상, 박사 미리 암에 의해 지원 되었다 빈센트 고 스텔라 Coates, 그리고 Damon Runyon 암 연구 재단 (DRG-2125-12)에서 관대 한 기여 금.

설치류와 관련 된 모든 절차 스탠포드 대학 지침, 국가 및 국가 법률 및 정책 준수에 맞 췄 나. 모든 동물 절차는 실험실 동물 관리에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 승인 되었다.
참고: 모든 솔루션 및 버퍼 구성 재료의 테이블에에서 제공 됩니다.
1. CD11b Immunopanning (하루 0)에 대 한 페 트리 접시를 준비
참고: 모든 1-2 청?...

     

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Microglia CNS의 센 티 넬 면역 세포 역할을, 때문에 그들은 높은 반응 환경 변화; 따라서, 주의 그들의 고립과 문화8동안 셀 내에서 선 동적인 응답을 최소화 하기 위해 필요 합니다. 이것은 속도 온도 통해이 프로토콜에서 수행 됩니다. 동물 차가운 관류 버퍼 끼얹는다는 가능한 크게 저하 활성화, 모든 원심 분리 단계 4 ° C에서 열릴 때마다 얼음에 또는 4 ° C에서 세포를 유지, 그리?...

CNS 실질의 대 식 세포로 microglia 신경 회로 폐해 신호 네트워크의 광대 한 배열을 상호 작용 합니다. 그들은 개발 및 시 냅 스의 가지 치기, apoptotic 세포 클리어런스 및 신경 프로세스1,2과도 상호 작용을 통해 뇌의 항상 성에 중요 한 역할. Microglia는 선 동적인 응답을 조정 및 제한 출혈3,4병 변 사이트에 그들의 길고, 얇은 프로세스를 확장 하는 신경 상해에 초기 응답자. Microglial 형태 및 기능에 변화는 급성 및 만성 CNS 상해에 유비 쿼터 스와 microglia 전시 변경 형태학, 지역화, 그리고 다양 한 질병 상태1에 염증 성 중재자의 표현. 인간 유전자 연구는 신경 퇴행 성 질환에 대 한 위험을 변경 하는 돌연변이 종종 주로 또는 독점적으로 표현 microglia microglia 질병 병 인 또는 진행5에 대 한 중요 한 역할을 가리키는 그대로 CNS에 의해 나타냅니다. . 상해 및 질병에 그들의 굴지를 감안할 때, 새로운 치료 접근을 개발 하기 위한 높은 우선 순위는 microglial 생물학의 이해 발전.
Microglial 생물학의 이해에 많은 중요 한 발전 기술과 문화 방법, 기능 정의 진 식 프로필, 등 다른 대 식 세포 인구의 학문에서 발견 하는 메커니즘을 바탕으로 발현 형태 / 상태. 대 식 세포 기능 CNS 풍경 내 놀라운 방법으로 자주 연주 일반화 microglia 스스로 매우 전문, 전시는 없는 형태 그리고 다른 조직 들을 차별 하는 독특한 유전자 식 서명 대 식 세포6. Microglia는 혈통은 다른 대부분의 다른 조직 대 식 세포; 그들은 원시 조의 초기 배아 파도 동안 CNS 식민지 하 고 자기 인생에 걸쳐, 최종 조7에서 기여의 독립 갱신. 성인 microglia의 완전히 성숙한 진 식 서명 하지 두 번째 출생 후 주8까지 이루어집니다. 주위 조직에서 환경 신호 특정 조직 대 식 세포 기능6, CNS에서 포함 하는 혈액-뇌 장벽9에 의해 부여 된 혈액 부담 요인에 제한 노출을 지시에 주요 역할을 한다.
완전히 microglial 기여 CNS 항상성 및 질병을 이해 하는 데 하나의 장애물은 업과 성숙한 microglia 본 비보에 순화 된 세포의 특수 속성의 어려움 생체 외에서. 많은 방법은 격리 하기 위해 개발 되었습니다 그리고 세포 생존을 지원 하기 위해 혈 청에 의존 하는 문화 그대로 microglia, 하지만 대부분의 방식. 우리는 본질적으로 가변 시 생리 활성 분자의 광대 한 배열을 포함 하는, 특히 문제가 microglia 작업 amoeboid 형태학 촉진 하기 때문에 증가 확산, 혈 청의 그 추가 나타났습니다 그리고 microglia 혈액-뇌 장벽 파괴 후 요소를 부담 하는 혈액에 노출 되 면 증가 먹어서9 vivo에서 수시로 보인다. 이 통계에 의해 혈 청 노출 셀 부상이 나 질병 상태, microglia 비슷하지만 이러한 변경 감소 때 microglia CSF-1 (또는 IL-34)를 포함 하는 정의 된 성장 매체, TGF-β, 콜레스테롤, 및 selenite 교양.
이 프로토콜 조건 하에서 혈 청 무료, 최근에 출판 된 작품9관련 청소년 쥐 microglia 경작에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜에서 출생 후 하루 21-30 (P21-P30), 쥐를 간소화 하지만 수율과 전반적인 생존 종 및 동물의 나이 따라 달라 집니다 하지만 microglia 쥐 및 쥐의 모든 나이에서 분리를 적용할 수 있습니다. 최대한 하 고 최적의 생존 때 약간 미 숙 microglia를 사용 하 여 얻을 수 있다 (~ P9), 수율 및 점차적으로 성인 동물에 있는 저수준에 다소 가늘게 생존. Microglia 또한 마우스에서 격리 될 수 있습니다 하지만 우리는 쥐 세포 보여 상당히 높은 수익률, 생존, 그리고 없는 형태학의 복잡성 마우스 셀 세럼 무료 문화에 비교 될 때 나타났습니다. 동물 세 P50 보다 큰이 프로토콜 평가 되지 않았습니다. 이 immunopanning 격리 절차는 격리 하는 동안 microglial transcriptional 프로필에 변화를 최소화 하 고 셀의 다운스트림 생존 능력을 극대화 하기 위해 최적화 되었습니다. 이러한 기술과 미디어 공식 사용, 높은 생존 능력 주 문화는 주에 대 한 지속 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 경작 Microglia 급속 한 확장 및 프로세스의 철회와 관련 된 매우 없는 형태를 전시 하 고 상대적으로 낮은 확산의 속도. 우리는 이러한 속성에 대 한 혈 청 노출의 중요성을 강조 하 고 힘과 다른 접근에 상대적으로이 방법의 약점을 토론.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat: Sprague-Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Cat# 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# MCA275R</td>
			<td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polycolonal anti-Iba1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# AB5076</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Ki67&#160;</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Cat# AB15580</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11055</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-21203</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-31573</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 28313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td>Galen Laboratory Supplies</td>
			<td>Cat# GAG-HS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# M3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from milk solids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# P6838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 100-35B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat# 5195-ML/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>Cat# 700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 354233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 90260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 20606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# DPRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat# 17-5445-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 21041-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Cat# 0100-20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat# 62406-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:25,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid/Gondoic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 50 &#956;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Douncing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 200 &#956;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panning Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglia Growth Medium (MGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &#956;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &#956;g/mL insulin, 100 &#956;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite 
			Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV Coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing 2 &#956;g/mL collagen IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Seperation Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &#956;L 1 M CaCl2, 5 &#956;L 1 M MgCl2 
			Comments: Mix well after the addition of&#160; CaCl2 and MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &#956;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &#956;g/mL heparan sulfate, 0.1 &#956;g/ml oleic acid, and 0.001 &#956;g/ml gondoic acid 
			Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &#176;C and do not add more than 1.5 &#956;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Microglia 모든 중앙 신경 시스템 (CNS) 세포의 5-10%를 대표 하 고는 점점 더 주목 그들의 공헌으로 인해 개발, 항상성, 및 질병. 세포 연구 세부에 십 년간, microglia의 특수 기능, CNS의 주민 조직 대 식 세포, 비록 성숙 microglial를 정리 하는 능력에서 제한 때문에 부분에서 크게 신비 남아 있다 문화에서 속성입니다. 여기, 우리는 성숙한 쥐 두뇌에서 순수한 microglia의 신속한 격리에 대 한 간단한 절차를 보여 줍니다. 우리는 또한 시간이 지남에 microglial 생존 능력의 높은 수준을 지 원하는 혈 청 무료 문화 조건을 설명 합니다. 이 정의 매체 조건 하에서 경작 Microglia 전시 정교한 없는 프로세스와 동적 감시 동작. 우리는 교양된 microglia에 혈 청 노출의 일부 효과 설명 하 고 이러한 혈 청 무료 문화 microglia 시내 vivo으로 혈 청 노출 문화 모두를 비교 하는 방법에 대해.

이 프로토콜 젊은 쥐에서 문화 고 순도 ramified microglia를 방법을 설명합니다. 비슷한 결과 얻어질 수 있다, 주 미 숙 하 고 성인 동물을 사용 하 여 아래 설명 된 대로. 셀 격리는 종종 미묘한 뉘앙스와 죽을 셀에 대 한 많은 기회를 포함, 우리는 다양 한 단계에서 성공을 확인 하는 데 품질 관리 검사점을 사용. 우리는 일반적으로 셀 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 격리 프로?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

The overall goal of this cell culture protocol is to generate highly pure cultures of microglia from developing or adult rodents that can be maintained without exposure to serum. This procedure can help answer key questions in neuroscience related to microglia morphology, fibrous ketosis, and microglia's interaction with other CNS cell types. The main advantage to this protocol is that microglia can be rapidly isolated from rodent tissue of any age and cultured without exposure to serum.To remove the brain, cut the occipital condyle from the spinal cord of an animal on both sides with dissection scissors, being careful not to damage the brain. Then, cut skin along the top of the skull, and cut up one side along the parietal and frontal bone towards the nasal bone. Carefully pull back the top of the skull with forceps, quickly remove the brain, and place it into prechilled DPBS on ice.Repeat the procedure for all remaining animals. After the brains have been collected in cold DPBS, chop each brain into one cube millimeter chunks in a petri dish on ice with a cold scalpel blade and transfer to an ice cold dounce homogenizer with five to seven milliliters of ice cold douncing buffer. Next, use a loose fitting dounce homogenizer to dissociate the tissue with 10 to 20 gentle and incomplete strokes.Take care not to directly crush the tissue at the bottom of the homogenizer. Instead, impel the tissue through the space between the sides of the piston and the homogenizer. It is important to slowly homogenize the tissue with multiple rounds of douncing to preserve microglia viability.Afterward, carefully remove the piston to prevent introducing air bubbles. Allow poorly dissociated tissue chunks to settle to the bottom of the homogenizer and transfer the supernatant to a new, chilled, 50 milliliter conical tube. Subsequently, replace the removed volume with fresh douncing buffer and repeat the dissociation procedure for a total of three to four rounds, or until all tissue has been dissociated.In this procedure, add ice cold douncing buffer to the 50 milliliter conical tube containing the cell suspension and adjust the total volume to 33.5 milliliters. Next, add 10 milliliters of MSB to the cell suspension and mix thoroughly by inverting the tube several times. This will result in a 23%final concentration of MSB in a volume of 43.5 milliliters.After that, centrifuge the cells for 15 minutes at 500 x g at 4 degrees Celsius with slow braking. Then, remove the top layer of myelin and debris and the supernatant with a pipette. Take care when removing the top layer to ensure as much of it is removed as possible.Following that, resuspend the cell pellet in 12 milliliters of panning buffer. Gently triturate the cell suspension to break up any remaining clumps of cells. In this step, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer to remove large debris or cell clumps.Rinse the OX42 coated panning dish three times with DPBS. Don't allow the plate to completely dry between washes. Pour off the last DPBS wash and apply the filtered cell suspension to the panning dish.Gently swirl the plate to distribute the cells. Then, incubate the plate on a flat surface at room temperature for 20 minutes to allow cells to adhere. Do not incubate longer than 20 minutes or cells will become very difficult to recover from the dish.Afterward, rinse the panning dish with DPBS 10 times to remove nonadherent cells. Microglia will be firmly attached to the plate, so swirl the plate with each rinse to ensure the removal of other nonadherent cells. Pour off the last DPBS wash and replace with 15 milliliters of DPBS and 200 microliters of trypsin.To trypsinize the cells, incubate the dish for less than or equal to 10 minutes at 37 degrees Celsius. After 10 minutes of trypsinization, microglia will still be stuck to the plate. Pour off the mixture and gently wash the plate two times with DPBS to remove the trypsin.Then, replace with 12 milliliters of ice cold MGM. Subsequently, place the panning dish on ice for two minutes to help weaken cell and substrate interaction and make sure that the dish is flat to prevent areas of the panning dish from drying out. After that, pipette vigorously with a 10 milliliter pipette and pipette controller on high speed to recover cells from the panning dish.Draw a 16 by 16 grid with the stream of liquid from the pipette to try and remove all of the cells. It is important to find a balance between overall cell recovery and the health of your culture. Repeated pipetting of the cell supernatant against the panning dish will result in reduced viability of your culture.Check the cells under a microscope at 20x magnification to make sure that they have detached from the plate. Mark the spots on top of the dish where cells are stuck and repeat pipetting in those areas. Collect the cell suspension and allocate three to four milliliters of supernatant in each 15 milliliter conical tube.Spin it for 15 minutes at 500 x g at four degrees Celsius with slow braking. After 15 minutes, aspirate the supernatant, leaving 0.5 milliliters of MGM with the cell pellet. Then, resuspend each pellet in remaining MGM and pull the cells from all the tubes.Following that, count the cells with a hemocytometer. Now, plate 15 microliters of collagen IV coating directly in the center of a 24 well anionic cationic coated tissue culture plate and incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius. After counting the cells with a hemocytometer, dilute them to 2.3 x 10 to the five per milliliter in MGM.Aspirate collagen IV spot and immediately plate 15 microliters of cell suspension to this spot to yield 3.5 x 10 to the three cells per spot. Next, incubate for five to ten minutes at 37 degrees Celsius to allow the cells to adhere. Then, gently add 500 microliters of CO2 equilibrated TIC to the well.If plating on cover slips, first coat the sterile glass cover slips with 10 micrograms per milliliter PDL in water for one hour at room temperature. Then, wash them three times with water and let them dry in a hood under UV light before proceeding with spot plating on the cover slips. In order to demonstrate successful isolation and culture of highly pure microglia, we isolated microglia from P21 rats and cultured these cells in TIC or TIC supplemented with 10%FCS for eight days.Cells were then fixed and stained with microglial markers and proliferation markers. Cells cultured in TIC show a ramified morphology, low levels of proliferation, and expression of microglia markers. In comparison, cells cultured in TIC supplemented with 10%FCS also stained for microglial markers, but show high levels of proliferation and amoeboid morphology, properties often seen in activated microglia.In addition to staining for cell markers, RNA-Seq on freshly isolated cells can provide a powerful and sensitive tool for evaluating the RNA profile of the cells and can help inform the starting purity of cultures. CD11b micropanning typically results in a small percentage of CD11b positive neutrophils and monocyte carryover, in addition to CD11b positive microglia. These cells will die in TIC after a few days, but can complicate analysis of earlier timepoints.Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after 14 DIV in TIC. After two weeks, serum free cultures show dynamic surveillance behavior with rapid process extensions and retractions throughout the dish. Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after five DIV in TIC before and after exposure to fetal calf serum.A rapid morphological change is evident after serum exposure. Once mastered, this protocol can be done in four to five hours, if performed properly. Following this procedure, other assays to monitor phagocytosis, chemotaxis, survival, cytokine release, transcriptional responses to stimuli, can be performed in order to answer additional questions about microglia function.After watching this video, you should have a good understanding on how to rapidly isolate microglia from adult rodent tissue and culture them under serum free conditions.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

동적 정량적 감각 테스트는 중앙 통증 처리의 특성을

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

나노 입자 신경 독성을 결정하는 대리 바이오 센서로 미세 아교 세포

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...