Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Detta arbete var stöds av Christopher och Dana Reeve Foundation International Research Consortium på ryggmärgsskada, Dr Miriam och Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, JPB Foundation, Novartis Institutet för grundläggande forskning, generösa bidrag från Vincent och Stella Coates, och Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Alla förfaranden som rör gnagare överensstämde till Stanford University riktlinjer, som uppfyller nationella och statliga lagar och politik. Alla djur förfaranden godkändes av Stanford University administrativa panelen på laboratorium djur vård.
Obs: Alla lösning och buffert kompositioner finns i Tabell för material.
1. Förbered en petriskål för CD11b Immunopanning (dag 0)
Obs: Förbereda 1 immunopanning maträ...

     

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Eftersom mikroglia fungera som sentinel immunceller i CNS, är de mycket lyhörda för förändringar i miljön; Därför krävs stor omsorg för att minimera inflammatoriska reaktioner i cellerna under deras isolering och kultur8. Detta sker i detta protokoll genom fart och temperatur. Att hålla cellerna på is eller vid 4 ° C närhelst möjligt minskar aktiveringen, så alla centrifugering steg ske vid 4 ° C, djuren är perfusion med iskall perfusion buffert och protokollet har effektiviserat...

Som makrofager av CNS parenkymet, mikroglia interagera med ett brett spektrum av neuronala kretsar och gliaceller signalering nätverk. De spelar avgörande roller i utveckling och homeostas av hjärnan via synaptic beskärning, apoptotiska cell clearance och övergående interaktioner med neuronala processer1,2. Mikroglia är tidiga responders till neurologiska skador, utvidga deras långa, tunna processer till lesion platser att samordna inflammatoriskt svar och begränsa blödning3,4. Förändringar i mikrogliala morfologi och funktion är allestädes närvarande i både akuta och kroniska CNS-skador och mikroglia utställning förändrad morfologi, lokalisering och uttryck av inflammatoriska mediatorer i ett varierat utbud av sjukdom stater1. Människans genetiska studier visar att mutationer som förändrar risken för neurodegenerativa sjukdomar uttrycks ofta huvudsakligen eller uteslutande av mikroglia i intakt CNS, pekar till en kritisk roll för mikroglia i sjukdomspatogenes eller progression5 . Med tanke på deras framträdande i skador och sjukdom, är främja förståelsen av mikrogliala biologi en hög prioritet för att utveckla nya behandlingsmetoder.
Många viktiga framsteg för förståelsen av mikrogliala biologi har uppstått genom att extrapolera tekniker och mekanism upptäcktes i studier av andra makrofag befolkningar, inklusive kultur metoder, gen uttryck profiler och definitioner av funktionella / morfologiska stater. Även om generell makrofag funktioner spelar ofta på överraskande sätt inom CNS landskapet, mikroglia är själva mycket specialiserad, uppvisar ett förgrenat morfologi och en unik gen uttryck signatur som skiljer dem från andra vävnader makrofager6. Mikroglia har en härstamning som skiljer sig från de flesta andra vävnad makrofager; de kolonisera CNS under en tidig embryonal våg av primitiva blodbildningen och själv förnya hela livet, oberoende av bidrag från slutgiltig blodbildning7. Fullt mogen gen uttryck signaturen av adult mikroglia uppnås inte förrän den andra postnatala vecka8. Miljömässiga ledtrådar från den omgivande vävnaden spela en viktig roll i dikterar vävnadsspecifika makrofag funktioner6, vilket i CNS inkluderar begränsad exponering för blodburna faktorer som beviljats av den blood - brain barriär9.
Ett hinder för att fullt ut förstå mikrogliala bidrag till CNS homeostas och sjukdom är svårigheten att går igenom specialiserade egenskaper för mogna mikroglia sett i vivo med renat celler in vitro-. Många metoder har utvecklats för att isolera och kultur intakt mikroglia, men de flesta metoder förlitar sig på serum att stödja cellöverlevnad. Vi har visat att tillägg av serum, som är ett inneboende variabel reagens som innehåller en stor mängd bioaktiva molekyler, är särskilt problematiskt när man arbetar med mikroglia eftersom det främjar en amoeboid morfologi, ökad spridning, och ökad fagocytos9 ses ofta i vivo när mikroglia utsätts för blodburna faktorer efter störningar av den blod - hjärnbarriären. Av dessa mätvärden, serum-exponerade celler liknar mikroglia i skador eller sjukdomstillstånd, men sådana förändringar reduceras när mikroglia odlas i definierade odlingsmedium som innehåller CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol och selenit.
Detta protokoll ger Detaljer för odling juvenil råtta mikroglia serumfritt villkor relaterade till nyligen publicerade arbete9. Detta protokoll har effektiviserats för råttor från den 21-30 (P21 - P30), men kan anpassas till isolera mikroglia från råttor och möss i alla åldrar, även avkastning och övergripande lönsamhet varierar beroende på art och djurets ålder. Maximal avkastning och optimal lönsamhet uppnås när du använder något omogen mikroglia (~ P9), avkastning och livskraftiga gradvis avsmalnande till något lägre nivåer i vuxna djur. Mikroglia kan också isoleras från möss, men vi har funnit att råtta celler visar betydligt högre avkastningen, livskraft och komplexiteten i förgrenat morfologier, jämfört med musen celler i serumfritt kulturer. Djur år större än P50 har inte utvärderats med detta protokoll. Proceduren immunopanning isolering har optimerats att minimera förändringar i mikrogliala transkriptionell profiler under isolering och maximera nedströms livskraften hos cellerna. Använda dessa tekniker och medier formuleringar, kan hög-livskraft primära kulturer upprätthållas i veckor. Mikroglia odlade under dessa förhållanden uppvisar ett starkt förgrenat morfologi som involverar snabba förlängning och indragning av processer och låga relativt priser för spridning. Vi framhålla betydelsen av serum-exponering på dessa egenskaper och diskuterar styrkor och svagheter med denna metod i förhållande till andra metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat: Sprague-Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Cat# 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# MCA275R</td>
			<td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polycolonal anti-Iba1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# AB5076</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Ki67&#160;</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Cat# AB15580</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11055</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-21203</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-31573</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 28313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td>Galen Laboratory Supplies</td>
			<td>Cat# GAG-HS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# M3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from milk solids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# P6838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 100-35B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat# 5195-ML/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>Cat# 700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 354233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 90260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 20606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# DPRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat# 17-5445-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 21041-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Cat# 0100-20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat# 62406-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:25,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid/Gondoic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 50 &#956;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Douncing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 200 &#956;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panning Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglia Growth Medium (MGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &#956;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &#956;g/mL insulin, 100 &#956;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite 
			Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV Coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing 2 &#956;g/mL collagen IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Seperation Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &#956;L 1 M CaCl2, 5 &#956;L 1 M MgCl2 
			Comments: Mix well after the addition of&#160; CaCl2 and MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &#956;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &#956;g/mL heparan sulfate, 0.1 &#956;g/ml oleic acid, and 0.001 &#956;g/ml gondoic acid 
			Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &#176;C and do not add more than 1.5 &#956;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Mikroglia utgör 5-10% av alla celler i centrala nervsystemet (CNS) och drar alltmer uppmärksamhet på grund av deras bidrag under utveckling, homeostas och sjukdom. Även om makrofager har studerats i detalj för årtionden, specialiserade funktioner av mikroglia, vävnad bosatta makrofager i CNS, har förblivit i stort sett mystiska, delvis på grund av begränsningar i förmågan att sammanfatta mogen mikrogliala boenden i kultur. Här visar vi ett enkelt förfarande för snabb isolering av ren mikroglia från mogna gnagare hjärnan. Vi beskriver också serumfritt odlingsbetingelser som stöder höga nivåer av mikrogliala lönsamhet över tid. Mikroglia odlade under dessa definieras-medium förhållanden uppvisar genomarbetade förgrenat processer och dynamisk övervakning beteende. Vi illustrerar vissa effekter av serumexponering på odlade mikroglia och diskutera hur dessa serumfritt kulturer jämfört med såväl serum-exponerade kulturer som mikroglia i vivo.

Det här protokollet beskriver en metod att kultur hög renhet förgrenad mikroglia från juvenila råttor. Liknande resultat kan erhållas med hjälp av omogna, perinatal och vuxna djur, som diskuteras nedan. Eftersom cellen isoleringar innehåller ofta subtila nyanserna och många möjligheter för cellerna att dö, använde vi kvalitetskontroll kontrollpunkter för att fastställa framgång vid olika steg. Vi övervakas vanligtvis cellsuspensioner använder en hemocytometer på flera s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Ansträngningar för att förstå mikrogliala funktion i detalj har hindrats av bristen på mikrogliala kultur modeller som sammanfatta egenskaperna för mogna i vivo mikroglia. Det här protokollet beskriver en isolering och kultur strategi för att upprätthålla robusta överlevnad av starkt förgrenat mogen råtta mikroglia definieras-medium villkor.

Isolering och kultur av gnagare mikroglia att främja en dynamisk förgrenad morfologi i serumfritt Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

The overall goal of this cell culture protocol is to generate highly pure cultures of microglia from developing or adult rodents that can be maintained without exposure to serum. This procedure can help answer key questions in neuroscience related to microglia morphology, fibrous ketosis, and microglia's interaction with other CNS cell types. The main advantage to this protocol is that microglia can be rapidly isolated from rodent tissue of any age and cultured without exposure to serum.To remove the brain, cut the occipital condyle from the spinal cord of an animal on both sides with dissection scissors, being careful not to damage the brain. Then, cut skin along the top of the skull, and cut up one side along the parietal and frontal bone towards the nasal bone. Carefully pull back the top of the skull with forceps, quickly remove the brain, and place it into prechilled DPBS on ice.Repeat the procedure for all remaining animals. After the brains have been collected in cold DPBS, chop each brain into one cube millimeter chunks in a petri dish on ice with a cold scalpel blade and transfer to an ice cold dounce homogenizer with five to seven milliliters of ice cold douncing buffer. Next, use a loose fitting dounce homogenizer to dissociate the tissue with 10 to 20 gentle and incomplete strokes.Take care not to directly crush the tissue at the bottom of the homogenizer. Instead, impel the tissue through the space between the sides of the piston and the homogenizer. It is important to slowly homogenize the tissue with multiple rounds of douncing to preserve microglia viability.Afterward, carefully remove the piston to prevent introducing air bubbles. Allow poorly dissociated tissue chunks to settle to the bottom of the homogenizer and transfer the supernatant to a new, chilled, 50 milliliter conical tube. Subsequently, replace the removed volume with fresh douncing buffer and repeat the dissociation procedure for a total of three to four rounds, or until all tissue has been dissociated.In this procedure, add ice cold douncing buffer to the 50 milliliter conical tube containing the cell suspension and adjust the total volume to 33.5 milliliters. Next, add 10 milliliters of MSB to the cell suspension and mix thoroughly by inverting the tube several times. This will result in a 23%final concentration of MSB in a volume of 43.5 milliliters.After that, centrifuge the cells for 15 minutes at 500 x g at 4 degrees Celsius with slow braking. Then, remove the top layer of myelin and debris and the supernatant with a pipette. Take care when removing the top layer to ensure as much of it is removed as possible.Following that, resuspend the cell pellet in 12 milliliters of panning buffer. Gently triturate the cell suspension to break up any remaining clumps of cells. In this step, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer to remove large debris or cell clumps.Rinse the OX42 coated panning dish three times with DPBS. Don't allow the plate to completely dry between washes. Pour off the last DPBS wash and apply the filtered cell suspension to the panning dish.Gently swirl the plate to distribute the cells. Then, incubate the plate on a flat surface at room temperature for 20 minutes to allow cells to adhere. Do not incubate longer than 20 minutes or cells will become very difficult to recover from the dish.Afterward, rinse the panning dish with DPBS 10 times to remove nonadherent cells. Microglia will be firmly attached to the plate, so swirl the plate with each rinse to ensure the removal of other nonadherent cells. Pour off the last DPBS wash and replace with 15 milliliters of DPBS and 200 microliters of trypsin.To trypsinize the cells, incubate the dish for less than or equal to 10 minutes at 37 degrees Celsius. After 10 minutes of trypsinization, microglia will still be stuck to the plate. Pour off the mixture and gently wash the plate two times with DPBS to remove the trypsin.Then, replace with 12 milliliters of ice cold MGM. Subsequently, place the panning dish on ice for two minutes to help weaken cell and substrate interaction and make sure that the dish is flat to prevent areas of the panning dish from drying out. After that, pipette vigorously with a 10 milliliter pipette and pipette controller on high speed to recover cells from the panning dish.Draw a 16 by 16 grid with the stream of liquid from the pipette to try and remove all of the cells. It is important to find a balance between overall cell recovery and the health of your culture. Repeated pipetting of the cell supernatant against the panning dish will result in reduced viability of your culture.Check the cells under a microscope at 20x magnification to make sure that they have detached from the plate. Mark the spots on top of the dish where cells are stuck and repeat pipetting in those areas. Collect the cell suspension and allocate three to four milliliters of supernatant in each 15 milliliter conical tube.Spin it for 15 minutes at 500 x g at four degrees Celsius with slow braking. After 15 minutes, aspirate the supernatant, leaving 0.5 milliliters of MGM with the cell pellet. Then, resuspend each pellet in remaining MGM and pull the cells from all the tubes.Following that, count the cells with a hemocytometer. Now, plate 15 microliters of collagen IV coating directly in the center of a 24 well anionic cationic coated tissue culture plate and incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius. After counting the cells with a hemocytometer, dilute them to 2.3 x 10 to the five per milliliter in MGM.Aspirate collagen IV spot and immediately plate 15 microliters of cell suspension to this spot to yield 3.5 x 10 to the three cells per spot. Next, incubate for five to ten minutes at 37 degrees Celsius to allow the cells to adhere. Then, gently add 500 microliters of CO2 equilibrated TIC to the well.If plating on cover slips, first coat the sterile glass cover slips with 10 micrograms per milliliter PDL in water for one hour at room temperature. Then, wash them three times with water and let them dry in a hood under UV light before proceeding with spot plating on the cover slips. In order to demonstrate successful isolation and culture of highly pure microglia, we isolated microglia from P21 rats and cultured these cells in TIC or TIC supplemented with 10%FCS for eight days.Cells were then fixed and stained with microglial markers and proliferation markers. Cells cultured in TIC show a ramified morphology, low levels of proliferation, and expression of microglia markers. In comparison, cells cultured in TIC supplemented with 10%FCS also stained for microglial markers, but show high levels of proliferation and amoeboid morphology, properties often seen in activated microglia.In addition to staining for cell markers, RNA-Seq on freshly isolated cells can provide a powerful and sensitive tool for evaluating the RNA profile of the cells and can help inform the starting purity of cultures. CD11b micropanning typically results in a small percentage of CD11b positive neutrophils and monocyte carryover, in addition to CD11b positive microglia. These cells will die in TIC after a few days, but can complicate analysis of earlier timepoints.Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after 14 DIV in TIC. After two weeks, serum free cultures show dynamic surveillance behavior with rapid process extensions and retractions throughout the dish. Here is a time lapse movie of P21 rat microglia after five DIV in TIC before and after exposure to fetal calf serum.A rapid morphological change is evident after serum exposure. Once mastered, this protocol can be done in four to five hours, if performed properly. Following this procedure, other assays to monitor phagocytosis, chemotaxis, survival, cytokine release, transcriptional responses to stimuli, can be performed in order to answer additional questions about microglia function.After watching this video, you should have a good understanding on how to rapidly isolate microglia from adult rodent tissue and culture them under serum free conditions.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatiserad Sholl Analys av digitaliserade Neuronal Morfologi på flera skalor

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikulär tillförsel av läkemedel till Gnagare Centrala nervsystemet

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Dynamisk Kvantitativ sensorisk testning för att karaktärisera central smärta Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Mikroglia som en surrogat Biosensor att bestämma nanopartiklar Neuro

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering och isolering av mus primära mikroglia täthet lutning centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolering och RNA-extraktion av nervceller, makrofager och mikroglia från Larval zebrafiskar hjärnor

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Kvantifiera mikroglia morfologi från mikrofotografier av immunhistokemi beredd vävnad med hjälp av ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generation oligodendrocyter och Oligodendrocyte-Konditionerat medium för samkulturexperiment

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...