Name: quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila at JoVE.com

Vi vil gerne takke William A. Eimer for tænkelig teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af kur Alzheimers fond [til R.E.T], det nationale Institut for sundhed [R01AG014713 og R01MH60009 til R.E.T; R03AR063271 og R15EB019704 til A.L.], og National Science Foundation [NSF1455613 til A.L.].

1. eksperimentel forberedelse
<ol><li>Forbered de følgende reagenser: Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% PARAFORMALDEHYD (PFA), fortyndet til 4% før brug; silikoneelastomer base og hærder; antifade montering medium (f.eks, forlænge guld); og Fingernegl polish.</li>
	<li>Forberede følgende udstyr: dissektion mikroskop, to skarpe pincet og en saks til microdissection, en række stifter til microdissection, en petriskål dissektion parabol, o...

<ol>
	<li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+mammalian+retina.">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li><li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+diversity+among+amacrine+cells:+implications+for+function.">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li><li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons.">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity.">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li><li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases.">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li><li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li><li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer's+disease.">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li><li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2.">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li><li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+through+Dishevelled,+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development.">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons.">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li><li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis.">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li><li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase/Furry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons.">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li><li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis.">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li><li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development.">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li><li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis.">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).</li><li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+reversal+of+Alzheimer's+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuriteTracer:+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth.">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li></ol>

Dendritter, der innerverer epidermis er regionerne input af neuroner, og deres morfologier bestemmer, hvordan oplysninger er modtaget og behandlet af individuelle neuroner. Udvikling dendrit morfologi afspejler gen graduering af dendrit organisation. Drosophila larve da neuron i det perifere nervesystem er en vigtig model til at studere dendrit udvikling på grund af: 1) til funktionel lighed med pattedyr11,12; 2) fire klasse udmærkelser baseret på den...

Dendritter, som er de forgrenede projektioner af en neuron, dækker det område, der omfatter de neuron sensoriske og synaptic input fra andre neuroner1,2. Dendritter er en vigtig komponent i synapse dannelse og spille en kritisk rolle i integration af synaptic indgange, samt formerings elektrokemiske stimulering i en neuron. Dendritiske arborization (da) er en proces, hvorved neuroner danner nye dendritiske træer og grene til at oprette nye synapser. Udvikling og morfologi af da, såsom filialtæthed og gruppering mønstre, skyldes en multi-step biologiske processer og er stærkt korreleret til neuronal funktion. Målet med denne protokol er at tilvejebringe en metode til kvantitativ analyse af neuronal dendritric arborization kompleksitet i Drosophila.
Kompleksiteten af dendritter bestemmer synaptic typer, tilslutningsmuligheder og indgange fra partner neuroner. Forgrening mønstre og tætheden af dendritter er involveret i behandlingen af de signaler, der konvergerer på dendritiske felt3,4. Dendritter har fleksibilitet for justering i udvikling. For eksempel, har synaptic signalering en effekt på dendrit organisation i den somatosensoriske neuron under den udviklingsmæssige fase og i den modne nervesystem5. Etablering af neuronal connectivity afhængig af morfogenese og modning af dendritter. Misdannelse af dendritter er forbundet med nedsat neuronal funktion. Undersøgelser har vist, at abnormitet af da neuron morfogenese kan bidrage til etiologies af flere neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington's chorea (HD), og Lou Gehrig sygdom / Amyotrofisk lateral sklerose (ALS)6,7,8. Synaptic ændringer vises i den tidlige fase af annonce, i koncert med forfald og forringelse af neuron funktion7,8. Detaljerne i hvordan dendrit patologi bidrager til patogenesen i disse neurodegenerative sygdomme er imidlertid fortsat undvigende.
Udviklingen af dendritter er reguleret af gener, der koder et komplekst netværk af tilsynsmyndigheder, som familien Wnt proteiner9,10, transkriptionsfaktorer og ligander på celle overfladen receptorer11,12 . Drosophila da neuroner består af fire klasser (klasse I, II III, IV), af hvilken klasse IV da neuroner har de mest komplekse forgrening mønstre og er blevet ansat som et stærkt eksperimenterende system for bedre forståelse morfogenese13, 14. Under tidlige morfogenese, overekspression og/eller RNAi hæmning af gener i klasse IV da neuroner resulterer i ændringer i forgrening mønstre og dendrit beskæring13. Det er vigtigt at udvikle en praktisk metode til kvantitativ analyse af de neuronale dendritiske arborization.
Vi har tidligere vist, at hæmning af Drosophila ortholog af SOX5, Sox102F, førte til kortere dendritter da neuroner og reduceret kompleksitet i klasse IV da neuroner15. Vi præsenterer her, af proceduren med kvantitativ analyse for neuronal dendritiske arborization kompleksitet (NDAC) i Drosophila. Denne protokol, tilpasset fra den tidligere beskrevne metode, giver en kortfattet metode til at analyse udviklingen af da sensoriske neuroner. Det illustrerer robust billede mærkning og da neuron i den tredje instar larve kroppen væggen16,17,18,19. Det er en værdifuld protokol for forskere, der ønsker at undersøge NDAC og udviklingsmæssige forskelle i vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Phosphate buffered saline(PBS)</td>
			<td style="width:223px;">Gibco Life Sciences</td>
			<td style="width:197px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:363px;">Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:197px;">15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:363px;">Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent</td>
			<td style="width:223px;">Dow Corning Corportation</td>
			<td style="width:197px;">3097366-0516;3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:363px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fingernail polish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">CVS</td>
			<td style="width:197px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri dish</td>
			<td style="width:223px;">Falcon</td>
			<td style="width:197px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Forceps</td>
			<td style="width:223px;">Dumont</td>
			<td style="width:197px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Insect Pins&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-6082-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:363px;">Microscope slides and cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">15-188-52</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila

Dendritter er de forgrenede fremspring af en neuron, og dendritiske morfologi afspejler synaptic organisation under udviklingen af nervesystemet. Drosophila larve neuronal dendritiske arborization (da) er en ideel model for at studere morfogenese af neurale dendritter og genfunktion i udviklingen af nervesystemet. Der er fire klasser af da neuroner. Klasse IV er den mest komplekse med en forgrening mønster, der dækker næsten hele området af larve kroppen væggen. Vi har tidligere karakteriseret effekten af silencing Drosophila ortholog af SOX5 på klasse IV neuronal dendritiske arborization kompleksitet (NDAC) ved hjælp af fire parametre: længden af dendritter, overfladearealet af dendrit dækning, de samlede antal filialer, og den forgrening struktur. Denne protokol udgør arbejdsgangen NDAC kvantitativ analyse, bestående af larve dissektion, Konfokal mikroskopi og billede analyse procedurer ved hjælp af ImageJ software. Yderligere indblik i da neuronal udvikling og dens underliggende mekanismer vil forbedre forståelsen af neuronal funktion og give et fingerpeg om de grundlæggende årsager til neurologiske og nervesystemets udvikling.

Dendritter da neuroner var mærket af co-overekspression normal god landbrugspraksis (UAS-normal god landbrugspraksis, ppk-GAL4) i da neurale soma og dendritiske Dorne til normal god landbrugspraksis fluorescens imaging analyse. Morfologi af da neuron dendritter var afbildet af en inverteret Konfokal mikroskop (figur 2).
Dendritter da neuroner blev sporet ved hjælp af Fiji ImageJ software. Filen bl...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila at JoVE.com

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Denne protokol fokuserer på kvantitativ analyse af neuronal dendritiske arborization kompleksitet (NDAC) i Drosophila, som kan bruges til undersøgelser af dendritiske morfogenese.

Kvantitativ analyse af Neuronal dendritiske Arborization kompleksitet i Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Det overordnede mål med denne procedure er at observere virkningen af SOX5-genet på kompleksiteten af dendritiske arborisering neuroner under neuronal udvikling i Drosophila. Denne metode kan hjælpe med at studere morfogenese af neuro-dendritter, og genfunktionen i udviklingen af nervesystemet, for bedre at forstå neurodegenerative sygdomsgener. I sidste ende denne teknik giver en kvantitativ analyse af dendritter kompleksitet, som kan bruges i mange forskellige typer af neuro-dendritter.Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod genetiske mekanisme af neuro-degenerative sygdom, fordi mutation har nøglen til at forstå genfunktion. Opsætskors af UAS-GFP;ppk-GAL4 med UAS-Sox102F-RNAi-stammefluer eller W118-kontroller. Kultur fluerne under standardbetingelser ved 25 grader Celsius.I omkring fem til seks dage, bruge kraftves til omhyggeligt at indsamle den tredje instar larver til dissektion. Placer en larve i en dissektion fad lavet af silicium elastomer base, og en væv-kultur Petriskål. Derefter placeres skålen under dissektionsmikroskopet.Nu pin halen af larverne til at udsætte midterlinjen. Så pin larver munden kroge, så larverne's dorsale side er op. Tilsæt nu 200 mikroliter PBS til skålen for at nedsænke larverne i opløsningen.Dernæst skæres halen og mundingen af larver med små snit. Skær derefter larven åben langs dorsal midterlinjen og mellem de to luftrør, der går fra hale til rostral. Derefter placere en pin på hver af de fire hjørner af kroppen, så kroppen ligger fladt.Fastgør nu larverkroppen i fire procent PFA i 25 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter larven med PBS tre gange i fem minutter pr. vask. Efter vask, fjerne stifterne og overføre vævet på et glas dias.Derefter nedsænkes vævet i antifade montering medium, og montere det med et dæksel slip. Lad det monterede væv lufttørre i en time, før du forsegler dækslet med neglelak. Opbevar disse dias i mørke ved fire grader Celsius.Tag billeder i z-serien med et konfokalt mikroskop ved hjælp af en 20X-målsætning. Først skal du indstille rækkevidden af z-trin til at omfatte alle DEN neuroner i larver kroppen væggen, og sæt trinstørrelsen til et halvt mikrometer. Gem derefter billederne som TIF- eller ND2-filer til behandling.Dernæst evaluere antallet og morfologien af dendritterne på DA neuroner. Begynd med at vurdere deres længder. Først i Fiji ImageJ, opdele billederne i separate kanaler, hvis det er nødvendigt.Det er kun GFP-kanalen, der skal vurderes. Dernæst lave en z-projektion. Vælg maks.Klik derefter på OK for at producere et z-projektionsbillede med klare dendrite-projektioner. Spor nu neuritterne ved hjælp af plug-in-værktøjet. Først skal du gå til soma af neuron af interesse og klik, hvor en dendrite fremgår af cellen kroppen.Klik derefter på spidsen af denne dendrite. Hvis den blå linje, der forbinder de to punkter, løber længden af neurite, skal du trykke på Y for ja. Hvis denne linje passer til neurites komplette sti, skal du klikke på hele stien.Hvis linjen ikke passer til stien, skal du klikke på punkter længere langs denne neurite for at bøje stien ind i flere linjesegmenter, der passer til længden af neuriten. Klik derefter på hele stien, og fortsæt med at markere stien til den næste neurite. Når du har fuldført alle vektoriseringsstier, skal du vælge indstillingen Analyse, Målstier for at eksportere stierne til en CSV-fil.Brug disse data til at beregne og gennemsnitlige værdi af stilængder til analyse. Dernæst beregne overfladearealet af neuron. Først skal du vælge det frie håndtegningsværktøj fra Fiji ImageJ-vinduet.Derefter forbinde endepunkter af neuron af interesse. Vælg derefter indstillingen Målpunkt i vinduet Analysér. Resultatet vises i en ny boks, hvor værdien for det markerede område er markeret.Kopier denne værdi til dataanalysesoftwaren. Endelig beregne det samlede antal grene ved hjælp af Analyze Skeletonized Stier plugin. Dendrites af DA neuroner blev mærket ved co-overexpressing GFP i deres soma og dendrite arbors for GFP florescence imaging analyse.Dendritters morfologi blev afbildet ved hjælp af et omvendt konfokal mikroskop. Dendritterne af DA neuroner blev sporet som beskrevet. Filen blev brugt til at anslå dendrite længde.Silencing af Sox102F i DA neuroner i den tredje instar larver førte til en betydelig reduktion i det samlede antal dendritter med omkring halvdelen af grenens længde og med en enklere struktur, der viser kun halvdelen af antallet af grene. Logisk, dette førte til reduktion i arbor overfladeareal. Denne protokol giver en hurtig metode til at vurdere udviklingen af DA sensoriske neuroner.Mens du forsøger denne procedure, sørg for at tage et rigeligt antal billeder af hver gruppe af DA neuroner for at få en god dækning. Efter denne procedure, andre metoder som dendrite analyse kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om dendrite udvikling. Da det er udvikling, denne teknik har hjulpet forskere inden for neurovidenskab gøre slutninger i neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers ved hjælp af modelsystemer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse af neurale aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Vurdering af dendritiske arborization i gyrus dentatus i hippocampus-regionen i mus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Kvantitativ analyse af Klatring Defekter i en Drosophila Model af neurodegenerative lidelser

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Vurdering af hippocampal dendritisk kompleksitet hos gamle mus ved anvendelse af Golgi-Cox-metoden

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Kvantitative cellebiologi af Neurodegeneration i Drosophila gennem saglig analyse af Fluorescently mærket proteiner ved hjælp af ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...