Name: ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche réalisé en laboratoire et développement (LDRD) du Lawrence Berkeley National Laboratory, soutenu par le Bureau de la Science, de l’US Department of Energy, sous le contrat no. DE-AC02-05CH11231 et le prix DE-SC0014079 de l’US Département de Energy Office of Science à l’Université de Berkeley. Travail à la fonderie moléculaire a été soutenu au titre US Département d’énergie contrat no DE-AC02-05CH11231. Nous remercions également Benjamin J. Cole au Lawrence Berkeley National Laboratory, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen et Suzanne M. Kosina pour leur aide.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les protocoles présentés ici pour l’utilisation de fabrication de l’écosystème pour créer Qu'ecofabs fournit des ressources communautaires pour la systématique des plantes dans des conditions très contrôlées en laboratoire des études de biologie. Avances dans l’impression 3D fournissent des technologies largement accessibles pour la construction et de manière itérative raffinage EcoFAB dessins. La chambre de racine, présentée ici s’avère bien adapté pour la microscopie par imagerie et maintien de la stérilité, permettant l’addition contrôlée de microbes pour étudier les interactions plantes-microorganismes. La plate-forme EcoFAB est compatible avec diverses espèces végétales. Il est important de reconnaître les effets physiologiques de plus en plus les plantes dans la chambre de racine étroite telle que des expériences supplémentaires devront avoir généraliser les conclusions aux plantes qui poussent dans des milieux naturels.
L’utilisation des chambres stériles et élèvent la lumière LED permet l’étude des effets des diverses conditions de lumière, y compris la longueur d’onde, intensité et durée, sur la croissance des plantes et des paramètres physiologiques associés en parallèle. Chambres de racine de liaison réversible permettent l’utilisation de substrats solides ainsi qu’à recueillir des échantillons solides pour les analyses biochimiques et génétiques dans l’espace. Les applications des substrats solides, tels que des sols, du sable et des perles de quartz, d’offrir la possibilité d’utiliser EcoFABs pour construire des écosystèmes de laboratoire plus écologiques pertinentes. Cependant, tous les systèmes présentés ici utilisation liquide saturé (cultures hydroponiques) qui ne sont pas un reflet exact de la plupart des sols et il faudra encore peaufiner ces dessins pour maintenir les poches d’air dans le sol tels qu’elles représentent mieux sols naturels.
L’utilisation de caméras simples et microscopes est décrite d’image système racinaire morphologie développement sur les deux en vrac aux niveaux cellulaires. Cette aptitude à l’imagerie de morphologie racine surveillance et quantification sera probablement utile pour comprendre les mécanismes de régulation de signaux physiologiques et moléculaires de plante déclenchées par adaptations génotypique plante à des conditions de croissance. Toutefois, une limitation pour étudier le développement racinaire physiologique est la position horizontale actuelle de l’appareil EcoFAB. En milieu naturel, la réponse gravitropique de racines conduit à un développement principalement vertical du système racinaire. Ainsi, le système horizontal présenté ici probablement diffère en certains facteurs du milieu naturel et la fabrication de systèmes EcoFAB avec placement vertical de la chambre de la racine est un objectif souhaitable pour les futures versions de EcoFAB. Bien que les dispositifs actuels de EcoFAB sont placées horizontalement, l’analyse des paramètres de morphologie de racine dans diverses conditions, ou en réponse aux microbes, est possible. Imagerie à haute résolution peut être appliqué pour saisir la dynamique de colonisation des racines des isolats unique ou des communautés, fournissant des informations sur quelle plante pièces sont colonisés dans diverses conditions suffisantes et déficientes en éléments nutritifs. Il est prévu que ces études fourniront des importantes nouvelles perspectives comment plante microbiomes sont assemblés, et comment ces dynamiques changent avec le temps, pour exemple que les racines se développent.
Dispositifs microfluidiques permettent d’imagerie de très jeunes plants, et généralement la quantité de métabolites collectées n’est pas suffisante pour l’analyse LCMS. Les systèmes axés sur les sols, tels que rhizotrons, permettent l’imagerie de la morphologie de la racine quand les deux plantes sont transformés par chimiluminescence construction (Glo-racine) ou avec des méthodes axées sur le NMR33,34. Les extractions de métabolite de ces systèmes demandent beaucoup de temps en raison du volume important d’échantillons. EcoFABs sont une combinaison des deux : la fabrication est similaire aux dispositifs microfluidiques. EcoFABs ont été conçus pour être simple et peu coûteux à reproduire, mais la taille de la chambre peut être ajustée pour faire pousser des plantes avec leur système racinaire petites ou grandes, jusqu'à des stades de reproduction. Des observations simultanées des changements de morphologie de racine et exsudation racinaire sont possibles. Le système est stérile, ce qui permet l’addition contrôlée de microbes spécifiques.
EcoFABs sont conçus pour permettre l’introduction contrôlée et échantillonnage des microbes et des métabolites. Spécifiquement, échantillons prélevés dans les chambres de croissance racinaire sont jugées suffisantes pour profiler le métabolite masse spectroscopique. L’intégration de l’imagerie de la spectrométrie de masse (p. ex.., NIMS technique présentée ici) propose une approche non destructifs d’étudier la distribution spatiale de métabolite des systèmes racinaires. Cette technique sera probablement utile dans un avenir stable isotope traçage expériences et localisation microbienne de cartographie aux métabolites spécifiques36. Alors que ce protocole a mis l’accent sur des isolats unique, la conception même certainement peut être utilisée que pour des collectivités plus complexes. Le volume des échantillons et la biomasse au sein de la EcoFABs sont probables plus que suffisant pour la poursuite de l’intégration avec les technologies de séquençage de l’ADN, qui sera important pour caractériser et surveiller la communauté microbienne structure et l’expression génique.
En conclusion, ce protocole détaille la fabrication des écosystèmes de laboratoire conçu pour l’étude des interactions plantes-microorganismes, en mettant l’accent sur des méthodes simples et accessibles qui peut facilement être implémentée et étendu par les chercheurs autour de la monde. Les efforts actuels visent à démontrer la reproductibilité entre les laboratoires et l’intégration d’un système de contrôle de température telle que chaque EcoFAB sera ont commandé indépendamment de lumière et température. Une progression supplémentaire du système sera l’intégration de l’échantillonnage automatique et le remplissage des chambres racine EcoFAB et de l’élaboration de protocoles reproductibles pour établir les microbiomes phytosanitaires pertinentes au sein de la EcoFABs.

L’application des microbes bénéfiques de plantes dans l’agriculture offre un grand potentiel d’augmenter l’alimentation durable et la production de biocarburants à fournir pour une population croissante1,2,3,4. Une quantité importante de travail confirment l’importance des plantes microbiomes dans l’absorption des éléments nutritifs végétaux, tolérance aux stress et résistance à la maladie5,6,7,8. Toutefois, il est difficile d’étudier ces mécanismes des interactions plantes-microorganismes dans les écosystèmes de champ en raison de la complexité et la reproducibilité associée et l’incapacité de contrôler avec précision la composition microbiome et génétique (p. ex.., en utilisant les mutants microbienne)4,9,10.
Une stratégie consiste à construire des écosystèmes modèle simplifié pour permettre contrôlée, des expériences de laboratoire répliqué étudie les interactions plantes-microorganismes pour générer des idées pouvant être testé plus loin dans la zone10,11, 12. Ce concept s’appuie sur des approches traditionnelles à l’aide de plantes cultivées dans des pots remplis de terre ou sur plaques de gélose dans les serres ou pépinières d’entreprises13. Même si elles resteront probablement le plus largement utilisé des approches, ils n’ont pas la capacité de précisément contrôler et manipuler des milieux de croissance végétale. À ces fins, rhizoboxes et rhizotrons représentent une amélioration majeure dans la possibilité d’étudier les processus sous terre14,15et, premiers protocoles ont été publiés pour l’analyse des métabolites de la rhizosphère en sol16. Plus récemment, pour permettre l’analyse à haut débit, microfluidique avancé dispositifs13,17 comme plante puce18,19, RootArray20et21de RootChip, ont été mis au point des outils efficaces pour le phénotypage d’usine avec une résolution spatiale-l’échelle du micromètre pour surveiller les premiers stades de croissance de la plante de petit modèle Arabidopsis thaliana en liquide fluide véhiculé. Récemment, une plate-forme d’imagerie de la bicouche a été décrite qui permet l’imagerie poils absorbants d’Arabidopsis thaliana au stade plantule avec une plate-forme de microfluidique22.
Ici, les protocoles détaillés pour la construction d’appareils de laboratoire (EcoFABs) sont fournies, pour étudier les interactions plantes microorganismes et montrent qu’ils peuvent servir à étudier diverses plantes y compris Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, l’écologiquement importante folle avoine Avena barbata et la récolte de bioénergie Panicum virgatum (Panic raide). EcoFAB est une plateforme de croissance végétale stérile qui comprend deux composants principaux : le dispositif EcoFAB et récipient transparent taille plante stérile. La EcoFAB périphérique est issu d’un polydiméthylsiloxane (PDMS), procédé qui consiste à coulée PDMS de fabrication des couches d’un moule en plastique imprimé 3D et collage des couches PDMS sur lames de microscope à l’aide des méthodes précédemment rapporté24,25 . Les procédures détaillées de workflow EcoFAB, telles que la fabrication de dispositifs, stérilisation, la germination des graines, transplantation des semis, microbe inoculation/la co-culture, préparation des échantillons et l’analyse, sont décrits dans le présent protocole (Figure 1). Autres modifications du flux de base sont décrites, y compris l’installation de l’ordinateur contrôlaient LED grow lights et l’utilisation des substrats solides. L’utilisation de techniques pour étudier la morphologie racinaire d’imagerie change, colonisation microbienne des racines, et l’Imagerie spectroscopique masse d’exsudats racinaires sont décrites. Nous prévoyons que le design simple et peu coûteux, issu des matériaux facilement disponibles, ainsi que les protocoles détaillés présentés ici, deviendra la plate-forme EcoFAB une ressource communautaire, normaliser les études en laboratoire usine-microbiome.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printed custom mold</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air duster spray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75780-350</td>
			<td>any compressed gas duster should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 gauge blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89166-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8221;x2&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.75&#34; x 2.56&#34; x 3.56&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005GAQ25Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; x 3 &#188;&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.87&#34; x 4.87&#34; x 5.50&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00P9QVOS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed custom clamp</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available from Trent Northen&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>AirClean&#160;Systems</td>
			<td>AC600 Series PCR Workstations</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE syringe tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z117315-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Pro-Mix PGX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71010-52-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-24 Col-4 Columbia wild type</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachypodium distachyon</td>
			<td>LBNL</td>
			<td>Standard Bd-21 line</td>
			<td>Available from John Vogel&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panicum virgatum</td>
			<td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td>
			<td>Alamo switchgrass</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9830-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVAC concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant&#8482; SPD111 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromotography system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1290 LC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive&#8482; Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIMS chip and custom MALDI plate</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI mass spectrometer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-coated LED grow light strip</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-SRB60F010-2835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC420 controller</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0197U7R8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone LED clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00N9X1GI0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B006IY359K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-bare LED connector cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-male LED connector extension cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-MF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20AWG 2-wire cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>6102051TFT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WAGO 221-415 Splicing Connector</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>221-415</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions

Interactions plantes-microorganismes bénéfiques offrent une solution biologique durable susceptibles de stimuler la production alimentaire et de la bioénergie de faibles consommations. Une meilleure compréhension mécaniste de ces interactions plantes-microorganismes complexes seront cruciale pour améliorer la production végétale comme écologique bien plus performante basic étudie les interactions sol-plante-microbe chargée de l’enquête. Ici, une description détaillée pour la fabrication de l’écosystème est présentée, à l’utilisation largement disponibles technologies d’impression 3D, pour créer des habitats contrôlées en laboratoire (EcoFABs) pour études mécanistes des interactions plantes-microorganismes dans spécifique environnementale conditions. Deux tailles de EcoFABs sont décrits qui conviennent pour l’étude des interactions microbiennes avec diverses espèces de plantes, y compris l’Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonet Panicum virgatum. Ces dispositifs intermédiaires permettant de contrôlé manipulation et échantillonnage de racine microbiomes, chimie de la racine ainsi que l’imagerie de la morphologie de la racine et localisation microbienne. Ce protocole comprend les détails pour le maintien des conditions stériles à l’intérieur de EcoFABs et montage indépendants systèmes de lumière LED sur EcoFABs. Méthodes détaillées pour l’ajout de différentes formes de médias, y compris les sols, sable et milieux de culture liquide couplée à la caractérisation de ces systèmes à l’aide de l’imagerie et métabolomique est décrites. Ensemble, ces systèmes permettent l’enquête détaillée et dynamique de la plante et plante-microbienne consortiums dont la manipulation de microbiome composition (y compris mutants), la surveillance de la croissance des plantes, la morphologie racinaire, composition de l’exsudat, et localisation microbienne dans des conditions environnementales contrôlées. Nous prévoyons que ces protocoles détaillés servira de point de départ important pour les autres chercheurs, idéalement aidant à créer normalisés systèmes expérimentaux pour l’étude des interactions plantes-microorganismes.

Chaque système EcoFAB muni d’un dispositif EcoFAB et une usine de taille de récipient en plastique transparent. Un seul appareil EcoFAB a un réservoir de l’usine, une chambre de croissance des racines, une entrée de débit de 1,6 mm et une prise de 1,6 mm pour appareil EcoFAB standard (Figure 2D & Figure 3 H) ou à une prise de 10 mm pour dispositif de EcoFAB wide-prise (Figure 2F & Figure 3I ). Le réservoir de l’usine est conçu en forme de trapèze qui possède une ouverture supérieure de 6 mm et 3 mm ouverture en bas, et cette conception réduit le risque de fuite de flux pendant l’injection de liquide et s’assure également de suffisamment d’espace pour la croissance des plantes. La chambre de croissance racinaire adopte une forme ovale avec une profondeur de 2 mm pour s’adapter à des systèmes racinaires des plantes beaucoup de modèles, comme le montre la Figure 2 et E. Canaux d’entrée et de sortie d’un dispositif de EcoFAB standard peuvent être connectés avec la tuyauterie de PTFE afin de solutions nutritives peuvent circuler dans la chambre de croissance racinaire, sans ouvrir le conteneur EcoFAB. Le dispositif de EcoFAB wide-prise grandement réduit la résistance à l’écoulement de la prise et est de préférence utilisé dans la culture des plantes à racines épaisses ou recueillir périodiquement des exsudats racinaires après que des systèmes racinaires complexes sont dérivés de plantes.
Les moules de coulée pour la fabrication de couches PDMS de EcoFAB dispositifs sont créés dans un logiciel de conception, et ensuite 3D imprimées en photopolymères opaque rigide, comme illustré à la Figure 2 et Figure 3. Plantes à l’intérieur de la EcoFABs peuvent être directement observés au microscope à l’aide d’une long travail distance, assurant que la stérile croître environnement (Figure 8 a, Dossier complémentaire 1). EcoFAB dispositifs avec des plantes peuvent également s’adapter sur une scène de microscopie à haute résolution, ce qui permet l’imagerie de résolution plus élevée des interactions plantes-microorganismes (Figure 8 b, Fichier supplémentaire 2). La stérilité n’est pas maintenue dans cet environnement, et l’imagerie haute résolution convienne donc uniquement pour les mesures de point de terminaison.
EcoFABs sont conçus pour permettre des études systématiques des plantes, telles que leur morphologie et métabolismes des communautés microbiennes à leurs stades de développement différents dans l’ensemble de leur cycle de vie. Ici, les EcoFABs ont été examinés comme une plate-forme générale d’étudier une variété d’espèces végétales. Figure 8 -E montrent 7 - jour vieux Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonet Panicum virgatum poussant dans EcoFABs. Tous trois ont été trouvés pour bien se développer dans la EcoFAB pendant plus d’un mois. Les dicotylédones, Arabidopsis thaliana tant les monocotylédones, Brachypodium distachyon trouvées s’acquittent de leurs stades de reproduction dans le EcoFABs.
Le réversible système d’étanchéité permet l’utilisation de substrats solides (p. ex.., sol) au sein de la EcoFABs (étape 2.2). Ce réversible approche d’étanchéité permet un chargement des substrats solides dans les chambres de croissance racinaire et permet également le prélèvement d’échantillons provenant de régions spécifiques de rhizosphères de racine. Figure 8F -H afficher un groupe âgé de 14 jour Brachypodium distachyon croissante en milieu hydroponique, ainsi que de sable et de terre additionnée de milieu hydroponique (sable) et d’eau (sol). La couche mince substrat solide en chambre de croissance racinaire permet à la lumière de pénétrer à travers pour imagerie microscopique des systèmes racinaires.
Morphologie de la racine est définie comme la configuration spatiale et de la distribution d’un système de racine de plante et a été approuvée comme une réponse de physiologie indispensables aux milieux de croissance variés, tels que des éléments nutritifs ou l’eau disponibilité32,33, 34. EcoFABs fournissent une approche commode d’étudier la morphologie végétale dans le temps ou dans des conditions différentes en éléments nutritifs. Figure 9 a-F montrent un exemple d’utilisation de EcoFABs pour suivre les morphologies de racine de Brachypodium distachyon dans les trois premières semaines. Un semis de Brachypodium distachyon a été transféré dans le dispositif EcoFAB et sa structure de racine a été enregistré par une caméra à l’intérieur d’un imageur de gel de BIO-RAD. Programme de traitement des images, comme Image J, python et matlab, peut être appliquée plus loin afin de quantifier les changements de morphologie de la racine dans le temps ou à des environnements différents moyens. La quantification de la surface des racines total au cours des trois semaines ont montré une augmentation progressive au stade précoce (< 1 semaine) suivie d’une tendance de croissance linéaire jusqu’au bout de trois semaines, comme le montre la Figure 9.
Une première motivation pour construire la EcoFAB est d’étudier les interactions plantes-microorganismes. Comme indiqué au point 5.4, les micro-organismes sont transférés dans la chambres de croissance racinaire de EcoFAB périphériques via le canal d’admission. La figure 10 illustre, un EcoFAB contenant Pseudomonas simea (anciennementfluorescens) WCS417 (WCS417), une croissance des plantes rhizobactéries avec des étiquettes de chimiluminescence, a été ajouté dans les systèmes de racine de plante avec une concentration de 106 cellules par plante. Le signal de WCS417 a été détecté avec un imageur de gel, ce qui indiquait une répartition spatiale distincte des microbes WCS417 en chambre de croissance racinaire. Dans les deux MS un milieu liquide avec et sans le sable substrat solid, microbes WCS417 a colonisé les surfaces du système racinaire entier avec microbes concentrés autour des zones de bout de racine, probablement à cause de la production de nutriments actif de radicelles (Figure 10 & H)35. En revanche, les microbes WCS417 dans un substrat de sol accumulent autour de la région de réservoir centrale au lieu de radicelles (Figure 10j’ai). Les microbes ont été ajoutés par le canal de sortie, les microbes étaient également capables de se déplacer dans le substrat du sol, mais n’ont pas accumulé dans la racine, comme observé dans un milieu liquide avec ou sans sable. Cela pourrait indiquer que le sol est une source suffisante de nutriments, et les microbes ont migré vers le réservoir de l’usine pour des conditions optimales de la respiration.
Pour étudier le métabolite profilage des exsudats racinaires de plante ainsi que l’absorption métabolite et libérer des interactions plantes-microorganismes, les solutions de l’exsudat des chambres de croissance racinaire ont été recueillies à travers différentes étapes de la croissance des plantes en EcoFABs. Tel que décrit à l’étape 6, exsudat échantillons sont ensuite extraits pour l’analyse de LC-MS. En utilisant cette méthode, une variété de métabolites exsudé par la plante et consommée par les microbes a été détectée, et le profilage de métabolite connexe d’exsudats racinaires avec et sans colonisation microbes est actuellement sous enquête.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figure 1 : EcoFAB le flux de travail. Plantes sont mises à germer sur la plaque et transférés à la EcoFAB stérilisé, microbes peuvent être ajoutés. Échantillonnage non destructif : exsudats racinaires peuvent être échantillonnés et imagés, et la morphologie racinaire peut être visualisée. Échantillonnage destructeur permet l’analyse de microbe, racine et paramètres de shoot en détail.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figure 2 : les composantes de la 3D imprimés de moules pour la fabrication de dispositifs EcoFAB. (A) vues haut et inclinés d’un châssis de moulage. (B) haut et inclinés vues d’une insertion. (C) haut et inclinés vues d’une base de moule standard. (E) haut et inclinés vues d’une base de sortie d’échelle du moule. (D, F) Assemblé de moules pour la fabrication de dispositifs de EcoFAB standards et sortie d’échelle, respectivement. Les dimensions ovales sont 51 x 34 mm pour le petit moule EcoFAB et 76 x 62 mm pour le grand moule EcoFAB. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figure 3 : fabrication de dispositifs EcoFAB. (A) verser le mélange d’élastomère base et polymérisation d’agent dans le moule. (B) le moule avec le mélange à 85 ° C pendant 4 h. (C), retirer le moule de l’insert de chauffage. (D) qui sépare le PDMS du cadre bâti. (E) en poussant le moule base hors du cadre bâti. (F) à l’aide d’un couteau pour séparer le PDMS de la moisissure sur les bords. (G) la couche PDMS lentement à sortir de la base de la moisissure s’écailler. Trous de piquer (H) pour les canaux d’entrée et de sortie de la couche PDMS standard. (I) piquer un trou pour le canal d’aspiration de la couche PDMS de large-sortie. Couche (J) le PDMS (constituée d’un élastomère de 15:1 base de mélange d’agent de polymérisation) et une lame de microscope sont rincés et transférés dans un plasma de nettoyeur pour le collage. (K) à l’aide pinces pour tenir la couche PDMS (faite d’une base d’élastomère de 5:1 pour mélange agent de polymérisation) sur une lame de microscope. (L) en appuyant sur la couche PDMS (faite d’une base d’élastomère de 30 : 1 au mélange d’agent de polymérisation) directement sur une lame de microscope. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figure 4 : la conception des colliers personnalisés. (A) vues haut et inclinés d’un haut collier plaque. (B) haut et inclinés vues du fond pince plaque. (C) haut et inclinés vues de pince assemblé avec quatre ensembles de vis d’assemblage. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figure 5 : installation LED grow lights. (A) marquage sur les emplacements pour les 9 clips LED dans une spirale autour du récipient EcoFAB. (B) LED pinces fixées au conteneur EcoFAB. (C) une bande de LED dans ces clips de thread. (D) reliant la bande de LED à un contrôleur filaire avec une alimentation de 24V. (E) le schéma de connexions des fils au contrôleur. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figure 6 : transfert de plantules dans EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon plantes cultivées pendant 2 jours sur une plaque de 0,5 MS. (B) remplir la chambre de racine avec substrat de croissance des plantes. (C) à l’aide d’une pince à insérer délicatement la racine dans le réservoir de l’usine. (D) d’étanchéité le conteneur EcoFAB avec ruban micropore, après l’ajout de 3 mL d’eau au fond du récipient. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figure 7 : NIMS imagerie de plante des racines dans EcoFABs. (A) un croissant dans un stérile EcoFAB Brachypodium distachyon . B fixer la couche PDMS avec la plante sur une puce de NIMS pour 20 min. (C) Using cuivre ruban pour attacher la puce NIMS sur une plaque personnalisée de MALDI et chargeant dans un spectromètre de masse MALDI. (D-G) un 7 - jour vieux et un 20 vieux jour Brachypodium distachyon plante utilisée pour NIMS imaging (D, E) et les images correspondantes de NIMS (F, G). Les ions prédominantes ont été soulignées en rouge, vert et bleu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figure 8 : les applications générales de EcoFABs. (A) directement saisir la croissance racinaire de Brachypodium distachyon dans un EcoFAB avec une configuration de microscope travail longue distance. (B) directement observer les interactions de racine-microbe avec une configuration de microscope haute résolution. Panicum virgatum (E) dans un milieu hydroponique 0,5 MS, âgé de 14 jour (F-H) Brachypodium distachyon cultivées en hydroponie 0,5 MS (F), sable (G) et du sol (H), Brachypodium distachyon (D) et (C-E) 7 - jour vieux Arabidopsis thaliana (C) substrat livré avec moyen de 0,5 MS et eau, respectivement. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figure 9 : pour étudier la morphologie de la racine à l’aide de EcoFABs. (A-F) Développement racinaire de Brachypodium distachyon gagne en EcoFABs rempli de 0,5 MS moyen au cours des trois premières semaines : (A) 2 jours, (B) 4 jours, (C) 7 jours, (D) 11 jours, e 14, (F) 21 jours de croissance. (G) surfaces de racine en moyenne ont été estimées en logiciels ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figure 10 : l’utilisation de EcoFABs pour étudier les racines-microbe interactions. (A, B, C) Un groupe d’âge de 15 jour Brachypodium distachyon colonisatrices avec Pseudomonas fluorescens WCS417 sous différentes formes de médias-MS substrats de solution, de sable et de terre liquides. (D, E, F) Photos de champ lumineux de leur système racinaire. (G, H, I) Les images de chimiluminescence correspondantes de ces systèmes racinaires après co-culture de 14 jours. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier complémentaire 1. À l’aide de EcoFAB pour capturer la croissance racinaire. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier complémentaire 2. À l’aide de EcoFAB pour capturer les interactions de racine-microbes. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

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