Name: ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt Labor leitete Forschung und Entwicklung (LDRD) Programm des Lawrence Berkeley National Laboratory unterstützt durch das Office of Science des US Department of Energy unter Vertragsnr. DE-AC02-05CH11231 und eine Auszeichnung DE-SC0014079 die US Abteilung von Energie Office of Science an der UC Berkeley. Arbeit in der molekularen Gießerei wurde unter US Abteilung von Energie Vertragsnr. unterstützt. DE-AC02-05CH11231. Wir danken auch Katherine Louie, Suzanne M. Kosina, Benjamin P. Bowen und Benjamin J. Cole am Lawrence Berkeley National Laboratory für all ihre Hilfe.

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Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).</li><li>R&#252;bel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenMSI:+A+High-Performance+Web-Based+Platform+for+Mass+Spectrometry+Imaging.">OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging.</a> Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).</li><li>L&#243;pez-Bucio, J., Cruz-Ram&#305;&#769;rez, A., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+nutrient+availability+in+regulating+root+architecture.">The role of nutrient availability in regulating root architecture.</a> Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).</li><li>Lynch, J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Protokolle erzielte hier mit Ökosystem Fertigung um zu schaffen EcoFABs bietet Community-Ressourcen für systematische Anlage Studium der Biologie in hohem Grade kontrollierten Laborbedingungen. Fortschritte in der 3D-Druck bieten allgemein zugängliche Technologien für den Bau und iterativ verfeinern EcoFAB Entwürfe. Die Wurzel Kammer hier vorgestellten festgestellt wird, gut geeignet für imaging-Mikroskopie und Aufrechterhaltung der Sterilität, ermöglicht kontrollierte Zugabe von Mikroben, Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Die EcoFAB-Plattform ist kompatibel mit verschiedenen Pflanzenarten. Es ist wichtig zu erkennen, physiologische Wirkungen von Pflanzen innerhalb der schmalen Wurzel Kammer, so dass zusätzliche Experimente benötigt werden, um Erkenntnisse zu Pflanzen, die in natürlichen Umgebungen zu verallgemeinern.
Die Verwendung von sterilen Kammern und LED Grow Licht ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Lichtverhältnissen, einschließlich Wellenlänge, Intensität und Dauer auf Pflanzenwachstum und physiologische Parameter parallel. Reversible Bindung Wurzel Kammern ermöglichen die Verwendung von festen Substraten als auch räumlich feste Proben für Biochemische und genetische Analyse sammeln. Die Anwendungen von festen Substraten, wie Böden, Sand und Quarz Perlen, bieten die Möglichkeiten der Verwendung von EcoFABs, um ökologisch relevanten Labor Ökosysteme zu konstruieren. Jedoch verfeinern alle Systeme, die hier vorgestellten Verwendung werden gesättigte Flüssigkeit (hydroponischen Kulturen), die kein genaues Bild von den meisten Böden und es sind wichtig, weiter diese Entwürfe Lufteinschlüsse im Boden zu halten, so dass sie besser vertreten Naturböden.
Die Verwendung von einfachen Kameras und Mikroskope ist auf Bild Wurzelsystem Morphologie Entwicklung auf beide Massen auf zellulärer Ebene beschrieben. Diese Eignung für Überwachung Wurzel Morphologie Bildgebung und Quantifizierung werden wahrscheinlich hilfreich für das Verständnis der regulatorischen Mechanismen der Pflanze physiologischen und molekularen Signale ausgelöst durch Anlage genotypischen Anpassungen an Wachstumsbedingungen. Eine Einschränkung für das Studium der physiologischen WURZELENTWICKLUNG ist jedoch die aktuelle horizontale Platzierung des EcoFAB Gerätes. In natürlichen Umgebungen führt die Wurzeln gravitropischer Antwort auf eine überwiegend vertikale Entwicklung des Wurzelsystems. So, das horizontale System wahrscheinlich hier vorgestellten unterscheidet sich in einigen Faktoren aus einer natürlichen Umgebung, und die Herstellung von EcoFAB Systemen mit vertikalen Positionierung der Wurzel Kammer ist ein erstrebenswertes Ziel für zukünftige Versionen der EcoFAB. Obwohl die aktuelle EcoFAB Geräte horizontal platziert werden, ist die Analyse der Root-Morphologie-Parameter unter verschiedenen Bedingungen oder als Reaktion auf Mikroben, möglich. Hochauflösende Bildgebung kann angewendet werden, um Wurzel Kolonisation Dynamik der einzelnen Isolate oder Gemeinschaften, Bereitstellung von Informationen über die Pflanze Teile in verschiedenen ausreichend und mangelhaft Nährstoffverhältnisse kolonisiert sind zu erfassen. Es wird davon ausgegangen, dass solche Studien liefern wichtige neue Erkenntnisse wie Pflanze mikrobiome montiert und wie diese Dynamik im Laufe der Zeit ändern, zum Beispiel als die Wurzeln entwickeln.
Mikrofluidische Geräte ermöglichen Bildgebung von sehr jungen Pflanzen, und die Menge an Metaboliten gesammelt reicht in der Regel nicht für LCMS Analyse. Boden-basierten Systemen, wie z. B. Rhizotrons, ermöglichen die Darstellung der Morphologie der Wurzel, wenn entweder die Pflanzen mit Chemilumineszenz Konstrukt (Glo-Wurzel) oder NMR-basierte Methoden33,34umgewandelt werden. Metabolit Extraktionen aus diesen Systemen sind zeitaufwendig durch großvolumige Proben. EcoFABs sind eine Kombination aus beidem: die Herstellung ist vergleichbar mit mikrofluidischen Geräten. EcoFABs wurden entwickelt, um einfach und kostengünstig zu reproduzieren, sondern die Größe der Kammer kann angepasst werden, um Pflanzen mit kleinen oder großen Wurzelsysteme, bis zu der reproduktiven Phase wachsen. Gleichzeitigen Beobachtungen der Wurzel Morphologie Änderungen und Wurzel Exsudation sind möglich. Das System ist steril, ermöglicht kontrollierte Zugabe von bestimmten Mikroben.
EcoFABs sollen kontrollierte Einführung und Probenahme von Mikroben und Metaboliten zu ermöglichen. Insbesondere finden Sie Proben von Wurzel Klimakammern für Masse spektroskopische Metabolit Profilierung ausreichend. Die Integration der Massenspektrometrie Bildgebung (zB., NIMS Technik hier vorgestellten) bietet einen nicht-destruktive Ansatz Metabolit räumliche Verteilungen des Wurzelsystems zu studieren. Diese Technik wird wahrscheinlich hilfreich in Zukunft stabiler Isotope Ablaufverfolgung Experimente und mikrobielle Lokalisierung Zuordnung zu bestimmten Metaboliten36sein. Während dieses Protokoll auf einzelne Isolate konzentriert hat, kann das gleiche Design sicherlich für komplexere Gemeinden verwendet werden. Das Probenvolumen und Biomasse innerhalb der EcoFABs sind wahrscheinlich mehr als ausreichend für eine weitere Integration mit DNA-Sequenzierung Technologien, die zur Charakterisierung und Überwachung von mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Gen Ausdruck wichtig sein wird.
Zusammenfassend, dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Labor Ökosysteme entwickelt, für die Untersuchung der Pflanze-Mikroben-Interaktionen, mit Schwerpunkt auf einfachen und verständlichen Methoden, die leicht umgesetzt und von den Forschern um erweitert werden kann die Welt. Aktuelle Bemühungen richten sich an die Reproduzierbarkeit von Labors und die Integration einer Temperatur-Steuerung demonstrieren, so dass jeder EcoFAB unabhängig Licht und Temperatur gesteuert haben. Eine Weiterentwicklung des Systems werden die Integration von automatisierten Probenahme und Nachfüllen der EcoFAB Wurzel Kammern und die Entwicklung der reproduzierbaren Protokolle für die Festlegung der entsprechenden Pflanze mikrobiome in EcoFABs.

Die Anwendung der positiven Pflanze-Mikroben in der Landwirtschaft bietet großes Potenzial für nachhaltige Ernährung und Biokraftstoff-Produktion für eine wachsende Bevölkerung1,2,3,4zu erhöhen. Eine erhebliche Menge an Arbeit unterstützt die Bedeutung der Pflanze-mikrobiome Pflanze Nährstoffaufnahme, Toleranz zu Spannungen und Widerstand gegen Krankheit5,6,7,8. Es ist jedoch schwierig, diese Mechanismen der Pflanze-Mikroben-Interaktionen im Bereich Ökosysteme aufgrund der Komplexität und damit verbundenen Unreproduzierbarkeit und Unfähigkeit zur Kontrolle genau Microbiome Zusammensetzung und Genetik zu untersuchen (zB. mit mikrobielle Mutanten)4,9,10.
Eine Strategie besteht darin, vereinfachtes Modell Ökosysteme ermöglichen konstruieren gesteuert, replizierte Laborversuchen untersucht Pflanze-Mikroben-Interaktionen um Erkenntnisse zu generieren, die weiter in den Bereich10,11getestet werden können, 12. Dieses Konzept baut auf traditionellen Ansätzen, die Verwendung von Pflanzen in Erde gefüllten Töpfe oder auf Agar-Platten in Gewächshäusern oder Inkubatoren13. Obwohl diese wahrscheinlich bleibt die am weitesten verbreitete Ansätze, ihnen fehlt die Fähigkeit, genau zu überwachen und manipulieren Pflanze Wachstum Umgebungen. Zu diesem Zweck Rhizoboxes und Rhizotrons stellen eine wesentliche Verbesserung in der Fähigkeit, unterirdische Prozesse14,15studieren und erste Protokolle wurden für die Analyse der Rhizosphäre Metaboliten im Boden16veröffentlicht. In jüngerer Zeit, um Hochdurchsatz-Analyse zu ermöglichen, wurden erweiterte mikrofluidischen Geräten13,17 wie Pflanze Chip18,19, RootArray20und RootChip21, entwickelt als effiziente Werkzeuge für die Pflanze Phänotypisierung mit Mikrometer-Skala räumliche Auflösung die frühen Entwicklungsstadien von der kleinen Modellpflanze Arabidopsis Thaliana in flüssigem Fördermedium zu überwachen. Vor kurzem wurde eine Zweischicht-Image Plattform beschrieben, die Wurzelhaare Bildgebung von Arabidopsis Thaliana im Keimlingsstadium mit einem mikrofluidischen Plattform22ermöglicht.
Hier sind detaillierte Protokolle für den Bau von kontrollierten Laborgeräte (EcoFABs) zur Verfügung gestellt, für das Studium der Pflanze-Mikroben-Interaktionen und zeigen, dass sie verwendet werden können, um diverse studieren Pflanzen einschließlich Arabidopsis Thaliana, Brachypodium Distachyon23, die ökologisch wichtigen Wildhafer Avena Barbata und die Bioenergie-Ernte Panicum Virgatum (Rutenhirse). EcoFAB ist eine sterile Pflanzen-Wachstum-Plattform, die zwei Hauptkomponenten umfasst: das EcoFAB Gerät und sterile Pflanze Mittlere durchsichtigen Behälter. Das EcoFAB, das Gerät ist aus einer Fertigung Prozess, bei dem Casting PDMS, Polydimethylsiloxan (PDMS) Schichten aus einem 3D bedruckte Kunststoff-Formenbau und Verklebung PDMS Schichten auf Objektträger mit Methoden zuvor berichtet,24,25 . Die Modalitäten der EcoFAB-Workflow, wie Gerät Fertigung, Sterilisation, Samenkeimung, Sämling Transplantation, Mikrobe Impfung/Cocultivation, Probenvorbereitung und Analyse, werden in diesem Protokoll (Abbildung 1) beschrieben. Weitere Modifikationen des grundlegenden Workflows werden beschrieben, einschließlich der Installation von Computer gesteuerten LED Grow Lights und die Nutzung von festen Substraten. Die Nutzung der bildgebenden Verfahren untersuchen Wurzel Morphologie ändert, mikrobielle Besiedlung der Wurzeln, und Masse spectroscopic Imaging Wurzelausscheidungen werden beschrieben. Wir erwarten, dass das einfache, kostengünstige Design basierend auf leicht verfügbaren Materialien, sowie die detaillierte Protokolle hier vorgestellte Gemeinschaft Ressource, die EcoFAB-Plattform wird Standardisierung Pflanze Microbiome Laborstudien.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printed custom mold</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air duster spray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75780-350</td>
			<td>any compressed gas duster should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 gauge blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89166-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8221;x2&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.75&#34; x 2.56&#34; x 3.56&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005GAQ25Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; x 3 &#188;&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.87&#34; x 4.87&#34; x 5.50&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00P9QVOS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed custom clamp</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available from Trent Northen&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>AirClean&#160;Systems</td>
			<td>AC600 Series PCR Workstations</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE syringe tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z117315-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Pro-Mix PGX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71010-52-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-24 Col-4 Columbia wild type</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachypodium distachyon</td>
			<td>LBNL</td>
			<td>Standard Bd-21 line</td>
			<td>Available from John Vogel&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panicum virgatum</td>
			<td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td>
			<td>Alamo switchgrass</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9830-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVAC concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant&#8482; SPD111 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromotography system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1290 LC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive&#8482; Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIMS chip and custom MALDI plate</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI mass spectrometer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-coated LED grow light strip</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-SRB60F010-2835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC420 controller</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0197U7R8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone LED clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00N9X1GI0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B006IY359K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-bare LED connector cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-male LED connector extension cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-MF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20AWG 2-wire cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>6102051TFT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WAGO 221-415 Splicing Connector</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>221-415</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions

Wohltuende Pflanze-Mikroben-Interaktionen bieten eine nachhaltige biologische Lösung mit dem Potenzial, Low-Input-Essen und Bioenergie-Produktion zu steigern. Ein besseres mechanistisches Verständnis dieser komplexen Pflanze-Mikroben-Interaktionen werden entscheidend für die Pflanzenproduktion zu verbessern, wie auch leistungsstarke grundlegende ökologische untersuchende Pflanze-Boden-Mikroben-Interaktionen Studien. Hier ist eine ausführliche Beschreibung zum Ökosystem Herstellung präsentiert mit allgemein verfügbaren 3D Drucktechnologien, um kontrollierten Labor Lebensräume (EcoFABs) für mechanistische Studien der Pflanze-Mikroben-Interaktionen innerhalb der spezifischen Umwelt zu schaffen, Bedingungen. Zwei Größen der EcoFABs werden beschrieben, die für die Untersuchung der mikrobielle Wechselwirkungen mit verschiedenen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis Thaliana, Brachypodium Distachyonund Panicum Virgatumgeeignet sind. Diese durchströmten Geräte zulassen für kontrollierte Manipulation und Beprobung von Stamm mikrobiome, Stamm Chemie sowie Bildgebung des Wurzel-Morphologie und mikrobielle Lokalisierung. Dieses Protokoll enthält die Details für die Aufrechterhaltung der steriler Bedingungen in EcoFABs und Montage unabhängige LED-Lichtsysteme auf EcoFABs. Detaillierte Methoden zur Ergänzung der verschiedenen Formen von Medien, einschließlich Böden, sand, und flüssige Wachstumsmedien gekoppelt bis hin zur Charakterisierung dieser Systeme mittels Bildgebung und Metabolomics werden beschrieben. Diese Systeme ermöglichen dynamische und detaillierte Untersuchung der Pflanze und Pflanze-mikrobielle Konsortien einschließlich der Manipulation des Mikrobiom Komposition (einschließlich Mutanten), die Überwachung von Pflanzenwachstum, Wurzel Morphologie, Exsudat Zusammensetzung, und mikrobielle Lokalisierung unter kontrollierten Umweltbedingungen. Wir erwarten, dass diese detaillierte Protokolle für andere Forscher, im Idealfall hilft standardisierte experimentelle Systeme für die Untersuchung von Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu erstellen als ein wichtiger Ausgangspunkt dienen soll.

Jedes EcoFAB System beinhaltet eine EcoFAB-Gerät und eine Pflanze großen transparenten Kunststoffbehälter. Ein EcoFAB Gerät hat eine Pflanze Reservoir, eine Wurzel-Wachstums-Kammer eine 1,6 mm Fluss Bucht und einen 1,6 mm Anschluss für standard-EcoFAB-Gerät (Abb. 2D & Abbildung 3 H) oder ein 10 mm Auslass für Wide-Steckdose EcoFAB Gerät (Abb. 2F & Abbildung 3I ). Die Pflanze Reservoir dient in eine Trapezform, das eine obere Öffnung 6 mm und 3 mm untere Öffnung, und dieses Design verringert die Wahrscheinlichkeit von fließen durchsickern während Flüssigkeitseinspritzung und sorgt auch für genügend Platz für das Pflanzenwachstum. Die Wurzel-Wachstum-Kammer nimmt eine ovale Form mit 2 mm Tiefe, viele Modellpflanzen Wurzelsysteme, passen, wie in Abbildung 2 und Egezeigt. Einlass und Auslass-Kanäle von einem standard EcoFAB-Gerät können mit PTFE Schläuche angeschlossen werden, so Nährlösungen in die Wurzel-Wachstums-Kammer fließen können, ohne den EcoFAB-Container zu öffnen. Wide-Steckdose EcoFAB Gerät reduziert den Strömungswiderstand der Steckdose, und dient vorzugsweise beim Anbau von Pflanzen mit dicken Wurzel-Systeme oder in regelmäßigen Abständen sammeln Wurzelausscheidungen nach komplexen Wurzelsysteme aus Pflanzen stammen.
Die Gussformen für die Herstellung von PDMS Schichten der EcoFAB Geräte werden in einem Design-Software erstellt, und dann 3D gedruckt in starren opaken Photopolymeren, wie in Abbildung 2 und Abbildung 3dargestellt. Pflanzen im Inneren EcoFABs können direkt beobachtet werden, mit einem Mikroskop mit einer langen Entfernung, sicherzustellen, dass die sterile Umgebung (Abbildung 8A, Ergänzende Datei 1) wachsen. EcoFAB Geräte mit Pflanzen passen auch auf einem hochauflösenden Mikroskop-Bühne, die höhere Auflösung Bildgebung der Pflanze-Mikroben-Interaktionen (Abbildung 8 b, Ergänzende Datei 2) ermöglicht. Sterilität ist nicht in diesem Umfeld gepflegt, und hochauflösende Bildgebung eignet sich daher nur für Endpunkt Messungen.
EcoFABs sollen systematische Untersuchungen von Pflanzen, wie ihre Morphologie, Stoffwechsel und mikrobieller Gemeinschaften in ihren verschiedenen Entwicklungsstadien über deren gesamten Lebenszyklus hinweg zu ermöglichen. Hier wurden EcoFABs als eine allgemeine Plattform für eine Vielzahl von Pflanzenarten zu studieren. Abbildung 8 -E zeigen 7 - Tage alten Arabidopsis Thaliana, Brachypodium Distachyonund Panicum Virgatum wächst in EcoFABs. Alle drei Pflanzen befanden sich gut in die EcoFAB über einen Monat lang wachsen. Sowohl der Dicot, Arabidopsis Thaliana und die Monocot, Brachypodium Distachyon erwiesen sich als zu ihrer Reproduktion Stadien in der EcoFABs gerecht zu werden.
Die Reversible Dichtungssystem ermöglicht die Verwendung von festen Substraten (zB., Boden) innerhalb der EcoFABs (Schritt 2.2). Diese Reversible Abdichtung Ansatz ermöglicht Laden der festen Substrate in Klimakammern Wurzel, und auch Probenentnahme aus bestimmten Regionen der Wurzel rhizosphären. Abbildung 8F -H zeigt eine Gruppe von 14 - Tage alten Brachypodium Distachyon wachsen in Hydrokultur Medium, sowie Sand und Erde mit Hydrokultur Medium (Sand) und Wasser (Boden) ergänzt. Die dünne feste Substratschicht in Klimakammern Wurzel lässt Licht durchdringen für mikroskopische Bildgebung des Wurzelsystems.
Root-Morphologie ist definiert als räumliche Konfiguration und Verteilung der ein Wurzelsystem der Pflanze und als wesentliche Physiologie Reaktion auf diverse Wachstum Umgebungen, wie Nährstoff oder Wasser Verfügbarkeit32,33genehmigt wurde, 34. EcoFABs bieten eine bequeme Herangehensweise Pflanze Morphologie zu studieren, im Laufe der Zeit oder unter verschiedenen Nährstoffverhältnisse. Abbildung 9A-F zeigen ein Beispiel für die Verwendung EcoFABs, um Wurzel Morphologien der Brachypodium Distachyon in den ersten drei Wochen zu verfolgen. Brachypodium Distachyon Sämling wurde in das EcoFAB-Gerät übertragen, und die Wurzelstruktur wurde von einer Kamera in einem BIO-RAD Gel Imager aufgenommen. Bildbearbeitungsprogramm, wie Bild J, Python und Matlab, kann weiter angewendet werden, um die Veränderungen der Wurzel Morphologien im Laufe der Zeit oder bei verschiedenen mittleren Umgebungen zu quantifizieren. Die Quantifizierung der gesamten Wurzelraum im Laufe von drei Wochen zeigten eine schrittweise Erhöhung der im frühen Stadium (< 1 Woche) gefolgt von einem linearen Wachstumstrend bis zum Ende der drei Wochen, wie in Abbildung 9dargestellt.
Eine primäre Motivation für den Bau der EcoFAB ist, Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Wie unter Punkt 5.4 beschrieben, werden Mikroorganismen in Klimakammern Wurzel von EcoFAB Geräten durch den Einlasskanal übertragen. Abbildung 10 zeigt, ein EcoFAB mit Pseudomonas Simea (ehemalsFluorescens) WCS417 (WCS417), ein Pflanzenwachstum fördern standarddüngung mit Chemilumineszenz Etiketten wurde hinzugefügt, in der Pflanze-Wurzel-Systeme mit einer Konzentration von 106 Zellen pro Pflanze. Das WCS417 Signal wurde mit einem Gel-Imager, entdeckt eine ausgeprägte räumliche Verteilung der WCS417 Mikroben in Klimakammern Wurzel angegeben. In beiden MS flüssigen Medium mit und ohne Sand festen Substrat kolonisiert WCS417 Mikroben die Oberflächen der gesamten Wurzelsysteme mit Mikroben konzentriert sich rund um die Wurzel-Tipp-Bereiche möglicherweise aufgrund der aktiven Nährstoffen Produktion von Wurzelspitzen (Abbildung 10 & H)35. Auf der anderen Seite die WCS417 Mikroben im Boden Substrat gesammelt rund um die Pflanze Reservoir Region anstelle von Wurzelspitzen (Abbildung 10ich). Wie die Mikroben durch den Auslasskanal hinzugefügt wurden, die Mikroben konnten auch im Boden Substrat bewegen, aber nicht auf die Wurzel ansammeln, wie im flüssigen Medium mit oder ohne Sand beobachtet. Dies könnte darauf hinweisen, dass der Boden eine ausreichende Nährstoff-Quelle ist, und die Mikroben auf die Pflanze Reservoir für optimale Atmung Bedingungen migriert.
Zu studieren, Metabolit Profilierung der Pflanze Wurzelausscheidungen sowie Metabolit Aufnahme und Entlassung aus der Pflanze-Mikroben-Interaktionen, wurde die Exsudat Lösungen aus der Wurzel Klimakammern in verschiedenen Wachstumsstadien der Pflanzen in EcoFABs gesammelt. Wie in Schritt 6 beschrieben, sind Exsudat Proben für LC-MS-Analyse dann extrahiert. Mit dieser Methode eine Reihe von Metaboliten ausgeschieden durch die Pflanze und von den Mikroben verbraucht wurde erkannt, und die damit verbundenen Metabolit Profilierung der Wurzelausscheidungen mit und ohne Mikroben Kolonisation wird derzeit untersucht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Abbildung 1: The EcoFAB Workflow. Pflanzen sind auf Platte gekeimt und übertragen die sterilisierten EcoFAB Mikroben können hinzugefügt werden. Zerstörungsfreien Probenahme: Wurzelausscheidungen abgetastet und abgebildet werden können, und Wurzel Morphologie visualisiert werden. Destruktive Probenahme ermöglicht die Analyse der Mikrobe, Wurzel und schießen Parameter im Detail.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Abbildung 2: die Komponenten des 3D gedruckt Formen für EcoFAB Gerät Fabrikation. (A) Draufsicht und schräge Ansicht aus einem Guss-Rahmen. (B) top und schräge Ansichten eines Einsatzes. (C) oben und geneigten Blick auf einen standard formenaufbau. (E) oben und geneigten Blick auf einen weiten Auslauf formenaufbau. (D, F) Zusammengesetzte Formen für die Herstellung von Standard- und Wide-Steckdose EcoFAB Geräte, bzw.. Die ovalen Abmessungen sind 51 x 34 mm für kleine EcoFAB Form und 76 mm x 62 mm für große EcoFAB Form. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Abbildung 3: EcoFAB Gerät Fabrikation. (A) Gießen die Mischung aus Elastomer-Basis und Aushärtung Agent in die Form. (B) heizen den Schimmel mit Mischung bei 85 ° C für 4 Std. (C) die Einlage aus der Form entfernen. (D) trennt die PDMS aus dem Casting-Rahmen. (E) drücken die Form Basis aus dem Casting-Rahmen. (F) mit einem Messer teilen, um die PDMS von Schimmel an den Rändern zu trennen. (G) Schälen der PDMS-Schicht langsam aus den formenaufbau. (H) Poking Löcher für Einlass und Auslass-Kanäle von der Standardebene PDMS. (I) stossen ein Loch für den Einlasskanal des Wide-Steckdose PDMS-Layers. (J) die PDMS Schicht (aus einem 15:1 Elastomer Basis zur Heilung Agent Mischung) und einen Objektträger sind gespült und übertragen in ein Plasma Reiniger für die Verklebung. (K) mit Klammern um die PDMS-Schicht (aus einem 5:1-Elastomer-Basis zur Heilung Agent Mischung) auf einen Objektträger zu halten. (L) drücken die PDMS-Schicht (aus einer 30,1-Elastomer-Basis zur Heilung Agent Mischung) direkt auf einen Objektträger. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Abbildung 4: das Design von benutzerdefinierten Schellen. (A) Draufsicht und schräge Ansicht eines Top Klemmen Platte. (B) Draufsicht und schräge Ansicht von unten spannen Platte. (C) oben und geneigten Blick auf montierte Schelle mit vier Gruppen von hex Kopfschrauben. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Abbildung 5: Installation von LED wachsen Lichter. (A) markieren Sie die Standorte für 9 LED Clips in einer Spirale um den EcoFAB-Container. (B) LED-Clips mit dem EcoFAB Behälter befestigt. (C) Einfädeln eines LED-Streifens durch diese Clips. (D) verbinden die LED-Leiste an einen Controller mit einem 24V Netzteil verdrahtet. (E) schematische Darstellung der Drahtverbindungen an den Controller. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Abbildung 6: Übertragung von Sämlingen in EcoFABs. (A) Brachypodium Distachyon Pflanzen für 2 Tage auf einem Teller 0,5 MS. (B) einfüllen die Wurzel Kammer Pflanze Wachstumsmedium. (C) mit Hilfe einer Pinzette sorgfältig die Wurzel der Pflanze Reservoir einzufügen. (D) Abdichtung des EcoFAB Behälters mit Zusammenarbeit Band, nach Zugabe von 3 mL Wasser auf den Boden des Behälters. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Abbildung 7: NIMS Bildgebung der Pflanze Wurzeln in EcoFABs. (A) eine Brachypodium Distachyon wachsen in einem sterilen EcoFAB. (B) Befestigung der PDMS-Schicht mit der Anlage auf einem NIMS-Chip für 20 min. (C) Using Kupfer Band den NIMS-Chip auf eine benutzerdefinierte MALDI-Platte befestigen und laden in einem MALDI-Massenspektrometer. (D-G) eine 7 - Tage alten und ein 20 - Tage alten Brachypodium Distachyon Anlage zur NIMS imaging (D, E) und die entsprechenden Bilder der NIMS (F, G). Die vorherrschenden Ionen wurden in rot, grün und blau hervorgehoben. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Abbildung 8: die allgemeine Anwendungen der EcoFABs. (A) direkt erfassen Wurzelwachstum der Brachypodium Distachyon in eine EcoFAB mit einem langen Distanz Mikroskop Setup. (B) direkt beobachten Wurzel-Mikroben-Interaktionen mit einem hochauflösenden Mikroskop-Setup. (C-E) 7 - Tage alten Arabidopsis Thaliana (C), Brachypodium Distachyon (D) und Panicum Virgatum (E) in Hydrokultur Medium 0,5 MS (F-H) 14 - Tage alten Brachypodium Distachyon gewachsen in 0,5 MS Hydrokultur (F), in Sand (G) und Erde (H) Substrat mit 0,5 MS Medium und Wasser, bzw. versorgt. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Abbildung 9: mit EcoFABs, um Wurzel Morphologie zu studieren. (A-F) WURZELENTWICKLUNG der Brachypodium Distachyon wachsen in EcoFABs gefüllt mit 0,5 MS Medium während der ersten drei Wochen: (A) 2 Tage, (B) 4 Tage, (C) 7 Tage, (D) 11, (E) 14 Tage, (F) 21 Tage des Wachstums. (G) gemittelte Wurzel Flächen wurden von ImageJ Software geschätzt. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Abbildung 10: mit EcoFABs, um Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu studieren. (A, B, C) Eine Gruppe von 15 - Tage alten Brachypodium Distachyon besiedeln mit Pseudomonas Fluorescens WCS417 in verschiedenen Formen von Medien-MS flüssige Lösung, Sand und Erde Substraten. (D, E, F) Hellfeld-Bilder von ihr Wurzelsystem. (G, H, ICH) Die entsprechenden Chemolumineszenz Bilder von dieser Wurzel-Systeme nach 14 Tagen Co-Kultur. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1. Mit EcoFAB um Wurzelwachstum. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2. Mit EcoFAB, um Wurzel-Mikroben Interaktionen zu erfassen. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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