Name: ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal programma laboratorio diretto di ricerca e sviluppo (LDRD) del Lawrence Berkeley National Laboratory supportati da Office of Science, del US Department of Energy sotto contratto n. DE-AC02-05CH11231 e un premio DE-SC0014079 da dipartimento US di energia Office of Science all'Università di Berkeley. Lavoro presso la fonderia molecolare è stato sostenuto sotto U.S. Dipartimento di energia contratto numero DE-AC02-05CH11231. Ringraziamo anche Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen e Benjamin J. Cole al Lawrence Berkeley National Laboratory per il loro aiuto.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I protocolli segnalato qui per l'utilizzo di fabbricazione ecosistema per creare che ecofabs fornisce risorse comunitarie per impianto sistematico studi di biologia in condizioni di laboratorio altamente controllate. I progressi nella stampa 3D offrono tecnologie ampiamente accessibili per costruire e perfezionare in modo iterativo EcoFAB disegni. La camera di root presentata qui è trovata per essere adatto per imaging microscopia e mantenere la sterilità, consentendo l'aggiunta controllata di microbi per indagare le interazioni piante-microrganismi. La piattaforma EcoFAB è compatibile con varie specie di piante. È importante riconoscere gli effetti fisiologici della crescita delle piante all'interno della camera di radice stretta tale che ulteriori esperimenti saranno necessario generalizzare i risultati a piante che crescono in ambienti naturali.
L'utilizzo di camere sterili e LED coltiva la luce consente l'indagine degli effetti delle diverse condizioni di luce, tra cui lunghezza d'onda, intensità e durata, sulla crescita delle piante e dei relativi parametri fisiologici in parallelo. Legame reversibile radice camere permettono l'utilizzo di substrati solidi anche per quanto riguarda spazialmente raccogliere campioni solidi per analisi biochimica e genetica. Le applicazioni di substrati solidi, quali terreni, sabbia e perle di quarzo, offrono la possibilità di usare EcoFABs per costruire gli ecosistemi di laboratorio più ecologicamente rilevanti. Tuttavia, tutti i sistemi presentati qui uso liquido saturo (colture idroponiche) che non sono una riflessione accurata della maggior parte dei suoli e sarà importante ulteriormente perfezionare questi disegni per mantenere le sacche d'aria all'interno del suolo tale che meglio rappresentano suoli naturali.
L'uso di macchine fotografiche semplici e di microscopi è descritto allo sviluppo di morfologia di radice sistema immagine a entrambi rinfusa ai livelli cellulari. Questa idoneità per monitoraggio radice morfologia imaging e quantificazione sarà probabilmente utile per comprendere i meccanismi di regolazione dei segnali fisiologici e molecolari di pianta innescati da adattamenti genotipica di pianta a condizioni di crescita. Tuttavia, una limitazione per studiare lo sviluppo fisiologico della radice è l'attuale posizionamento orizzontale del dispositivo EcoFAB. Negli ambienti naturali, la risposta di radici gravitropic conduce ad uno sviluppo prevalentemente verticale del sistema della radice. Così, il sistema orizzontale presentato qui probabilmente differisce in alcuni fattori da un ambiente naturale, e la realizzazione di sistemi di EcoFAB con posizionamento verticale della camera principale è un obiettivo desiderabile per le future versioni di EcoFAB. Sebbene i dispositivi EcoFAB correnti vengono posizionati orizzontalmente, l'analisi dei parametri di morfologia radice in varie condizioni, o in risposta ai microbi, è possibile. Formazione immagine ad alta risoluzione può essere applicata per l'acquisizione dinamica di colonizzazione radice singoli isolati o comunità, fornendo informazioni su quale pianta parti sono colonizzati in varie condizioni sufficienti e carente dei nutrienti. Si prevede che tali studi forniranno importanti nuove intuizioni come pianta microbiomi vengono assemblati, e come queste dinamiche cambiano nel tempo, per esempio come le radici si sviluppano.
Attivare dispositivi microfluidici imaging di piante molto giovani, e di solito la quantità di metaboliti raccolti non è sufficiente per l'analisi LCMS. Sistemi basati su terreno, ad esempio rhizotrons, consentono l'imaging della morfologia della radice quando entrambi le piante si trasformano con costrutto chemiluminescente (Glo-radice) o con metodi basati su NMR33,34. Estrazioni di metabolita da questi sistemi sono molto tempo a causa del grande volume di campioni. EcoFABs sono una combinazione di entrambi: la fabbricazione è simile a dispositivi microfluidici. EcoFABs sono stati progettati per essere semplice e poco costoso da riprodurre, ma la dimensione della camera può essere regolata per crescere le piante con piccoli o grandi sistemi di radice, fino a loro fasi riproduttive. Osservazioni simultanee di cambiamenti di morfologia di radice ed essudazione di radice sono possibili. Il sistema è sterile, consentendo l'aggiunta controllata di microbi specifici.
EcoFABs sono progettati per consentire l'introduzione controllata e campionamento dei microbi e dei metaboliti. In particolare, campioni raccolti da camere di crescita di radice si trovano ad per essere sufficiente per il profiling del metabolita massa spettroscopica. L'integrazione di imaging con spettrometria di massa (ad es., NIMS tecnica presentata qui) fornisce un approccio non-distruttivo di studiare distribuzioni spaziali di metabolita degli apparati radicali. Questa tecnica sarà probabilmente esperimenti di analisi isotopica utile in futuro e mappatura microbica localizzazione di specifici metaboliti36. Mentre questo protocollo si è concentrata su singoli isolati, lo stesso design certamente può essere utilizzato per comunità più complesse. I volumi di campione e la biomassa all'interno del EcoFABs sono probabilmente più che sufficiente per un'ulteriore integrazione con tecnologie di sequenziamento del DNA, che sarà importante per caratterizzare e monitoraggio comunità microbica struttura ed espressione genica.
In conclusione, questo protocollo dettaglia la fabbricazione degli ecosistemi di laboratorio progettato per l'indagine sulle interazioni piante-microrganismi, con enfasi sui metodi semplici e accessibili che può essere facilmente implementato ed estesa dai ricercatori di tutto il mondo. Attuali sforzi sono volti a dimostrare la riproducibilità tra laboratori e l'integrazione di un sistema di controllo di temperatura tale che ogni EcoFAB sarà hanno controllato in modo indipendente luce e temperatura. Un ulteriore avanzamento del sistema sarà l'integrazione di campionamento automatico e riempimento delle camere EcoFAB radice e lo sviluppo di protocolli riproducibile per stabilire il relativo impianto microbiomi all'interno EcoFABs.

L'applicazione di microbi benefici pianta in agricoltura offre un grande potenziale per aumentare la produzione di biocarburanti per fornire per una crescente popolazione1,2,3,4e alimentare sostenibile. Una quantità significativa di lavoro sostiene l'importanza della pianta microbiomi nell'assorbimento dei nutrienti della pianta, tolleranza agli stress e resistenza alla malattia5,6,7,8. Tuttavia, è difficile indagare questi meccanismi delle interazioni piante-microrganismi negli ecosistemi di campo dovute alla complessità e irriproducibilità associato e incapacità di controllare con precisione la composizione microbiome e genetica (ad es., usando microbica mutanti)4,9,10.
Una strategia consiste nel costruire gli ecosistemi di modello semplificato per consentire controllato, esperimenti di laboratorio replicate indagare interazioni piante-microrganismi per generare intuizioni che possono essere ulteriormente testati nel campo10,11, 12. Questo concetto si basa su approcci tradizionali utilizzando piante coltivate in vasi riempiti di terreno o su lastre di agar all'interno di serre o incubatori13. Anche se queste probabilmente rimarrà il più ampiamente utilizzati approcci, essi mancano della capacità di precisamente monitorare e gestire ambienti di crescita della pianta. A tal fine, rizobox e rhizotrons rappresentano un importante miglioramento nella capacità di studiare i processi sotto-terra14,15, e protocolli prime sono stati pubblicati per l'analisi dei metaboliti della rizosfera nel suolo16. Più recentemente, per consentire analisi di rendimento elevato, microfluidici avanzati dispositivi13,17 come pianta Chip18,19, RootArray20e RootChip21, sono stati sviluppato come strumenti efficaci per fenotipizzazione di pianta con risoluzione spaziale di scala micrometrica per monitorare le prime fasi di crescita della pianta piccolo modello Arabidopsis thaliana in medium liquido di flusso. Recentemente, una piattaforma di formazione immagine di due-strato è stata descritta che permette l'imaging dei capelli di radice di Arabidopsis thaliana nella fase del semenzale con una piattaforma di microfluidica22.
Qui, protocolli dettagliati per la costruzione di dispositivi controllati del laboratorio (EcoFABs) sono forniti, per lo studio delle interazioni pianta microbo e spettacolo che può essere utilizzati per studiare varie piante tra cui Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, l'avena Avena barbata, ecologicamente importante e il raccolto di bioenergia Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB è una piattaforma di crescita di pianta sterile che include due componenti principali: il dispositivo EcoFAB e contenitore trasparente dimensioni impianto sterile. EcoFAB dispositivo è costituito da un polidimetilsilossano (PDMS) produzione processo che coinvolge colata PDMS strati da uno stampo di plastica stampato 3D e incollaggio di strati PDMS sui vetrini microscopio utilizzando metodi precedentemente segnalato24,25 . Le procedure dettagliate di EcoFAB del flusso di lavoro, come la fabbricazione di dispositivi, sterilizzazione, germinazione del seme, trapianto di piantine, microbo inoculazione/cocultivation, preparazione del campione e l'analisi, sono descritte in questo protocollo (Figura 1). Ulteriori modifiche del flusso di lavoro base sono descritte, compreso l'installazione del computer controllato luci a LED grow e l'utilizzo di substrati solidi. L'utilizzo di tecniche per studiare la morfologia della radice di imaging cambia, colonizzazione microbica delle radici, e imaging massa spettroscopico di essudati radicali sono descritti. Possiamo anticipare che il design semplice, poco costoso, basato su materiali facilmente reperibili, nonché i protocolli dettagliati qui presentati, si trasformerà la piattaforma EcoFAB in una risorsa di comunità, standardizzando le ricerche di laboratorio pianta-microbiome.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printed custom mold</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air duster spray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75780-350</td>
			<td>any compressed gas duster should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 gauge blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89166-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8221;x2&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.75&#34; x 2.56&#34; x 3.56&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005GAQ25Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; x 3 &#188;&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.87&#34; x 4.87&#34; x 5.50&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00P9QVOS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed custom clamp</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available from Trent Northen&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>AirClean&#160;Systems</td>
			<td>AC600 Series PCR Workstations</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE syringe tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z117315-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Pro-Mix PGX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71010-52-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-24 Col-4 Columbia wild type</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachypodium distachyon</td>
			<td>LBNL</td>
			<td>Standard Bd-21 line</td>
			<td>Available from John Vogel&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panicum virgatum</td>
			<td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td>
			<td>Alamo switchgrass</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9830-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVAC concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant&#8482; SPD111 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromotography system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1290 LC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive&#8482; Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIMS chip and custom MALDI plate</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI mass spectrometer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-coated LED grow light strip</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-SRB60F010-2835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC420 controller</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0197U7R8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone LED clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00N9X1GI0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B006IY359K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-bare LED connector cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-male LED connector extension cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-MF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20AWG 2-wire cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>6102051TFT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WAGO 221-415 Splicing Connector</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>221-415</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions

Interazioni piante-microrganismi benefici offrono una soluzione biologica sostenibile con il potenziale per incrementare la produzione alimentare e bioenergia basso input. Una migliore comprensione meccanicistica di queste interazioni piante-microrganismi complessi sarà cruciale per migliorare la produzione vegetale come ben più performante basic ecologico studi investigativi interazioni pianta-suolo-microbo. Qui, viene visualizzata una descrizione dettagliata per la fabbricazione di ecosistema, utilizzando ampiamente disponibili tecnologie di stampa 3D, per creare habitat controllati del laboratorio (EcoFABs) per studi meccanicistici di interazioni piante-microrganismi all'interno di specifiche ambientali condizioni. Due dimensioni di EcoFABs sono descritti che sono adatti per l'indagine sulle interazioni microbiche con varie specie di piante, tra cui Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatum. Questi dispositivi di scorrimento consentono controllata manipolazione e campionamento di radice microbiomi, chimica di radice nonché di imaging della morfologia della radice e della localizzazione microbica. Questo protocollo include i dettagli per mantenere condizioni di sterilità all'interno EcoFABs e montaggio di sistemi di illuminazione LED indipendente sul EcoFABs. Metodi dettagliati per l'aggiunta di diverse forme di media, compresi i suoli, sabbia e mezzi liquidi di sviluppo accoppiato alla caratterizzazione di questi sistemi usando la formazione immagine e metabolomica è descritti. Insieme, questi sistemi consentono indagini dinamico e dettagliato della pianta e pianta-microbica consorzi tra cui la manipolazione del microbioma composizione (tra cui mutanti), il monitoraggio della crescita delle piante, morfologia della radice, composizione di essudato, e localizzazione microbica in condizioni ambientali controllate. Ci aspettiamo che questi protocolli dettagliati servirà come punto di partenza importante per altri ricercatori, idealmente contribuendo a creare sistemi standardizzati sperimentale per lo studio di interazioni piante-microrganismi.

Ogni sistema EcoFAB include un dispositivo di EcoFAB e una pianta di dimensioni contenitore di plastica trasparente. Un dispositivo di EcoFAB ha un serbatoio di impianto, una camera di crescita di radice, un'insenatura di flusso di 1,6 mm e una presa di 1.6 mm per dispositivo EcoFAB standard (Figura 2D & H di figura 3) o una presa di 10 mm per wide-Saldi EcoFAB dispositivo (Figura 2F & Figura 3I ). La pianta è stata progettata a forma trapezoidale che ha un'apertura superiore di 6 mm e l'apertura inferiore di 3 mm, e questa struttura riduce la probabilità di perdita di flusso durante l'iniezione di liquido e garantisce anche abbastanza spazio per la crescita delle piante. La camera di crescita di radice adotta una forma ovale con 2 mm di profondità per adattarsi apparato radicale delle piante modello molti, come mostrato in Figura 2 ed E. Canali di ingresso e di uscita di un dispositivo di EcoFAB standard possono essere collegati con tubi in PTFE così soluzioni nutritive possono fluire nella camera di crescita di radice senza aprire il contenitore EcoFAB. Il dispositivo EcoFAB wide-Saldi notevolmente riduce la resistenza al flusso della presa e preferibilmente viene utilizzato quando la coltivazione di piante con sistemi della radice spessi o essudati radicali periodicamente raccolta dopo complessi sistemi della radice sono derivati dalle piante.
Gli stampi di colata per la realizzazione di strati PDMS dei dispositivi EcoFAB vengono creati in un software di progettazione e quindi 3D stampato in rigida fotopolimeri opaco, come mostrato nella Figura 2 e Figura 3. Piante all'interno di EcoFABs possono essere direttamente osservate con un microscopio utilizzando una distanza di lavoro lungo, assicurando che la sterile crescere ambiente (Figura 8A, File supplementari 1). EcoFAB dispositivi con piante possono anche montare su un palcoscenico di microscopio ad alta risoluzione, che permette l'imaging a risoluzione più alta delle interazioni piante-microrganismi (Figura 8B, File supplementari 2). Sterilità non è mantenuto in questo ambiente, e imaging ad alta risoluzione solo è quindi adatto per misure di endpoint.
EcoFABs sono progettati per consentire studi sistematici di piante, come la loro morfologia, metabolismi e comunità microbiche nelle loro fasi di crescita differenti tra loro cicli di vita. Qui, EcoFABs sono stati esaminati come una piattaforma generale per studiare una varietà di specie vegetali. Figura 8 -E Visualizza 7 - giorno-vecchio di Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatum crescendo in EcoFABs. Tutti i tre impianti sono stati trovati per crescere bene nella EcoFAB per oltre un mese. Sia le dicotiledoni, Arabidopsis thaliana e le monocotiledoni, Brachypodium distachyon sono stati trovati a vivere fino al loro fasi di riproduzione nella EcoFABs.
Il reversibile sistema di tenuta consente l'utilizzo di substrati solidi (ad es., suolo) all'interno di EcoFABs (punto 2.2). Questo approccio di sigillamento di reversibile consente il caricamento di substrati solidi in camere di crescita di radice e consente inoltre la raccolta di campioni da regioni specifiche e di metodologie di radice. Figura 8F -H Visualizza un gruppo di 14 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon crescendo in mezzo idroponico, come sabbia e terreno completati con mezzo idroponico (sabbia) e acqua (terreno). Lo strato sottile substrato solido in camere di crescita di radice permette alla luce di penetrare per formazione immagine microscopica degli apparati radicali.
Morfologia della radice è definito come configurazione spaziale e la distribuzione di un sistema di radice di pianta ed è stato approvato come risposta fisiologia essenziali per gli ambienti di crescita diversificata, come sostanza nutriente o acqua disponibilità32,33, 34. EcoFABs fornire un approccio conveniente di studiare la morfologia della pianta nel tempo o in condizioni diverse sostanze nutritive. Figura 9A-F Visualizza un esempio di utilizzo di EcoFABs per tenere traccia di morfologie di radice di Brachypodium distachyon nelle prime tre settimane. Una piantina di Brachypodium distachyon fu trasferita nel dispositivo EcoFAB, e la struttura principale è stata registrata da una telecamera all'interno di un imager di gel BIO-RAD. Programma di elaborazione di immagine, come immagine J, python e matlab, possa essere applicato per quantificare le modifiche delle morfologie di radice nel tempo o a diversi ambienti medi. La quantificazione dell'area radice totale nel corso di tre settimane ha mostrato un aumento graduale nella fase iniziale (< 1 settimana) seguita da un trend di crescita lineare fino alla fine di tre settimane, come illustrato nella Figura 9.
Una motivazione primaria per la costruzione del EcoFAB è quello di indagare le interazioni piante-microrganismi. Come descritto al punto 5.4, microrganismi vengono trasferiti in camere di crescita di radice di EcoFAB dispositivi attraverso il canale di ingresso. La figura 10 Mostra, un EcoFAB contenente Pseudomonas simea (precedentementefluorescens) WCS417 (WCS417), una crescita di pianta Promozione rhizobacteria con etichette a chemiluminescenza, è stato aggiunto in sistemi della radice di pianta con una concentrazione di 106 cellule per pianta. Il segnale di WCS417 è stato rilevato con un imager di gel, che ha indicato una distinta distribuzione spaziale dei microbi WCS417 in camere di crescita di radice. In entrambi MS mezzo liquido con e senza sabbia substrato solido, WCS417 microbi colonizzarono le superfici dei sistemi della radice intera con microbi concentrati intorno alle aree di punta di radice, possibilmente dovuto la produzione attiva di nutrienti di punte delle radici (Figura 10 & H)35. D'altra parte, i microbi WCS417 nel substrato di terreno accumulato intorno alla regione di serbatoio pianta invece di punte delle radici (Figura 10ho). Come i microbi sono stati aggiunti tramite il canale di sbocco, i microbi sono stati anche in grado di muoversi nel substrato del terreno, ma non si accumulano sulla radice, come osservato in mezzo liquido con o senza sabbia. Questo potrebbe indicare che il terreno è una fonte di nutrienti sufficiente, e i microbi migrarono al serbatoio impianto per condizioni di respirazione ottimale.
Per studiare il profiling del metabolita di essudati radicali pianta così come metabolita assorbimento e rilascio dalle interazioni piante-microrganismi, le soluzioni di essudato dalle camere di crescita di radice è stato raccolto attraverso varie fasi di crescita delle piante in EcoFABs. Come descritto nel passaggio 6, campioni di essudato vengono poi estratti per analisi LC-MS. Usando questo metodo, una gamma di metaboliti trasudava dalla pianta e consumato dai microbi è stata rilevata, e il profiling del metabolita correlata di essudati radicali con e senza colonizzazione di microbi è attualmente sotto inchiesta.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro The EcoFAB. Piante sono germinati sulla piastra e trasferiti a EcoFAB sterilizzati, i microbi possono essere aggiunti. Campionamento non distruttivo: essudati radicali possono essere campionati ed imaged e morfologia della radice possa essere visualizzato. Campionamento distruttivo permette l'analisi di microbo, radice e sparare parametri in dettaglio.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figura 2: I componenti di 3D stampato stampi per la fabbricazione di dispositivi EcoFAB. (A) viste superiore e inclinate di un frame di colata. (B) viste superiore e inclinate di un'istruzione insert. (C) alto e inclinati visualizzazioni di una base di stampo standard. (E) viste superiore e inclinate di un wide-Saldi stampo base. (D, F) Assemblati stampi per fabbricare dispositivi EcoFAB standard e wide-presa di corrente, rispettivamente. Le dimensioni ovale sono 51 x 34 mm per la piccola EcoFAB muffa e 76 mm x 62 mm per grandi EcoFAB muffa. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figura 3: fabbricazione di dispositivi EcoFAB. (A) versare il composto di base e polimerizzazione agente di elastomero nello stampo. (B) riscaldamento dello stampo con la miscela a 85 ° C per 4 h. (C) rimozione dell'inserto dallo stampo. (D) che separa il PDMS dal telaio della colata. (E) spingendo lo stampo base fuori della cornice di colata. (F) utilizzando un coltello per separare il PDMS dallo stampo lungo i bordi. (G) peeling lo strato PDMS lentamente fuori la base dello stampo. (H) Poking fori per canali di ingresso e di uscita del livello standard PDMS. (I) che prendono in un buco per il canale di ingresso del livello PDMS wide-presa. Strato (J) il PDMS (costituito da un elastomero di 15:1 base di miscela di agente di polimerizzazione) e un vetrino da microscopio sono sciacquati e trasferiti in un plasma pulitore per l'incollaggio. (K) tramite morsetti per tenere il livello PDMS (in una base di 5:1 in elastomero per polimerizzazione miscela agente) su un vetrino da microscopio. (L) premendo lo strato PDMS (in una base di elastomero di 30: 1 a miscela agente di polimerizzazione) direttamente su un vetrino da microscopio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figura 4: il design dei morsetti personalizzati. (A) viste superiore e inclinate di un top piastra di serraggio. (B) piastra di serraggio viste superiore e inclinate di un fondo. (C) superiore e vista inclinata del morsetto assemblato con quattro serie di viti a testa esagonale. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figura 5: installazione LED coltiva le luci. (A) marcatura fuori le posizioni per 9 clip LED in una spirale attorno al contenitore EcoFAB. (B) il LED clip collegato al contenitore EcoFAB. (C) una striscia di LED attraverso queste clip di threading. (D) la striscia di LED di collegamento a un controller cablato con un'alimentazione elettrica 24V. (E) lo schema dei collegamenti dei cavi al controller. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figura 6: trasferimento di piantine in EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon piante coltivate per 2 giorni su una zolla di 0,5 MS. (B) la principale camera di riempimento con mezzo di crescita della pianta. (C) utilizzando una pinzetta per inserire con cautela la radice nel serbatoio dell'impianto. (D) sigillare il contenitore EcoFAB con nastro microforato, dopo l'aggiunta di 3 mL di acqua alla parte inferiore del contenitore. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figura 7: NIMS imaging della pianta radici in EcoFABs. (A) un Brachypodium distachyon crescendo in una sterile EcoFAB. (B) Posizionare lo strato PDMS con la pianta su un chip di NIMS per 20 min (C) usando rame nastro collegare il chip NIMS su un piatto MALDI personalizzato e caricarlo in uno spettrometro di massa MALDI. (D-G) uno 7 - giorno-vecchio e un 20 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon pianta usata per NIMS imaging (D, E) e le corrispondenti immagini di NIMS (F, G). Gli ioni predominanti sono stati evidenziati in rosso, verde e blu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figura 8: le applicazioni generali di EcoFABs. (A) direttamente catturare la crescita delle radici di Brachypodium distachyon in un EcoFAB con un setup di microscopio di distanza lungo lavoro. (B) direttamente osservando le interazioni di radice-microbo con un setup di microscopio ad alta definizione. Panicum virgatum (E) in mezzo idroponico di 0,5 MS, (F-H) 14 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon coltivato in idroponica 0,5 MS (F), in sabbia (G) e terreno (H), Brachypodium distachyon (D) e (C-E) 7 - giorno-vecchio thaliana di Arabidopsis (C) substrato fornito con 0,5 MS Media e acqua, rispettivamente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figura 9: utilizzo di EcoFABs per studiare la morfologia della radice. (A-F) Lo sviluppo delle radici di Brachypodium distachyon crescendo in EcoFABs riempito con il mezzo di 0,5 MS durante le prime tre settimane: (A) 2 giorni, (B) 4 giorni, (C) 7 giorni, (D) 11 giorni, (E) 14 giorni, (F) 21 giorni di crescita. (G) aree di superficie media radice sono state stimate dal software ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figura 10: utilizzando EcoFABs per studiare le interazioni di radice-microbo. (A, B, C) Un gruppo di 15 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon colonizzando con Pseudomonas fluorescens WCS417 in diverse forme di media-MS substrati di soluzione, sabbia e terreno liquidi. (D, E, F) Immagini di campo luminoso dei loro sistemi di root. (G, H, I) Le immagini corrispondenti a chemiluminescenza di questi sistemi di radice dopo co-coltura di 14 giorni. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari 1. Usando EcoFAB per catturare la crescita delle radici. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2. Usando EcoFAB per catturare interazioni radice-microbi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Questo articolo descrive protocolli dettagliati per la fabbricazione di ecosistema di dispositivi (EcoFABs) che permettono studi di piante e interazioni piante-microrganismi in condizioni di laboratorio altamente controllate.

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