Name: ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo programa de laboratório dirigido a investigação e desenvolvimento (LDRD), do Lawrence Berkeley National Laboratory suportado pelo escritório da ciência, do departamento de energia dos EUA, sob contrato n º DE-AC02-05CH11231 e um prêmio DE-SC0014079 do Estados Unidos Departamento de energia escritório da ciência para UC Berkeley. Trabalho na fundição Molecular foi apoiado sob E.U. departamento da energia contrato n º DE-AC02-05CH11231. Agradecemos também Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen e Benjamin J. Cole no Lawrence Berkeley National Laboratory por toda sua ajuda.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Os protocolos aqui relataram para o uso de fabricação do ecossistema para criar que ecofabs fornece recursos comunitários para planta sistemática estudos de biologia em condições de laboratório altamente controlado. Avanços na impressão 3D fornecem tecnologias amplamente acessíveis para construir e refinar iterativamente EcoFAB projetos. A câmara de raiz aqui apresentada é encontrada para ser adequados para a microscopia de imagem e manter a esterilidade, permitindo a adição controlada de micróbios para investigar interações planta-micróbio. A plataforma EcoFAB é compatível com várias espécies de plantas. É importante reconhecer os efeitos fisiológicos de crescer as plantas dentro da câmara de raiz estreita tal que experimentos adicionais deverão generalizar conclusões para plantas que crescem em ambientes naturais.
O uso de câmaras estéril e cresce a luz LED possibilita a investigação dos efeitos das diversas condições de luz, incluindo o comprimento de onda, intensidade e duração, no crescimento das plantas e parâmetros fisiológicos relacionados em paralelo. Câmaras de raiz de ligação reversível permitam a utilização de substratos sólidos também quanto espacialmente coletar amostras sólidas para análise bioquímica e genética. As aplicações de substratos sólidos, como solos, areia e grânulos de quartzo, oferecem as possibilidades do uso EcoFABs construir ecossistemas de laboratório mais ecologicamente relevantes. No entanto, todos os sistemas aqui apresentados ainda mais uso líquido saturado (culturas hidropónicas) que não são um reflexo preciso da maioria dos solos e isso será importante para refinam estes projetos para manter os bolsos de ar dentro do solo, tal que melhor representam solos naturais.
O uso de câmeras simples e microscópios é descrito para o desenvolvimento de morfologia de raiz sistema de imagem em ambos em massa aos níveis celulares. Esta aptidão para monitoramento de imagem de morfologia de raiz e quantificação provavelmente será útil para compreender os mecanismos de regulação dos sinais fisiológicos e moleculares planta desencadeados por adaptações genotípica de planta para as condições de crescimento. No entanto, uma limitação para estudar o desenvolvimento fisiológico da raiz é o atual posicionamento horizontal do dispositivo EcoFAB. Em ambientes naturais, a resposta de gravitropic raízes leva a um desenvolvimento predominantemente vertical do sistema radicular. Assim, o sistema horizontal apresentado aqui provavelmente difere em alguns fatores de um ambiente natural, e a fabricação de sistemas EcoFAB com posicionamento vertical da câmara de raiz é um objetivo desejável para as futuras versões EcoFAB. Embora os dispositivos EcoFAB atuais são colocados horizontalmente, a análise de parâmetros de morfologia de raiz em várias condições, ou em resposta aos micróbios, é possível. Imagem de alta resolução pode ser aplicada para capturar a dinâmica de colonização de raiz de único isolados ou comunidades, fornecendo informações sobre qual planta peças são colonizadas em várias condições suficientes e deficientes de nutrientes. Prevê-se que tais estudos fornecerá importantes novos insights sobre como planta microbiomes são montados, e como essas dinâmicas mudam ao longo do tempo, por exemplo, como as raízes desenvolver.
Dispositivos microfluídicos permitem imagens de plantas muito jovens, e geralmente a quantidade de metabolitos recolhidos não é suficiente para análise LCMS. Sistemas baseados em solo, tais como rhizotrons, permitem a geração de imagens da morfologia da raiz quando as plantas também são transformadas com construção quimioluminescente (Glo-raiz) ou com métodos baseados em NMR33,34. Extrações de metabólito destes sistemas são demoradas por causa do grande volume de amostras. EcoFABs são uma combinação de ambos: a fabricação é similar aos dispositivos microfluídicos. EcoFABs foi projetados para ser simples e barata para reproduzir, mas o tamanho da câmara pode ser ajustado para crescer plantas com pequenas ou grandes sistemas de raiz, até seus estágios reprodutivos. Observações simultâneas de alterações de morfologia de raiz e exsudação de raiz são possíveis. O sistema é estéril, permitindo a adição controlada de micróbios específicos.
EcoFABs são projetados para permitir a introdução controlada e amostragem de micróbios e seus metabolitos. Especificamente, amostras colhidas em câmaras de crescimento de raiz são encontradas para ser suficiente para massa espectroscópico metabólito profiling. A integração de imagens de espectrometria de massa (ex., NIMS técnica apresentada aqui) fornece uma abordagem não-destrutiva de estudar distribuições espaciais de metabólito de sistemas da raiz. Esta técnica provavelmente será útil no futuro isótopos rastreamento experimentos e localização microbiana de mapeamento de metabolitos específicos36. Enquanto este protocolo centrou-se na único isolados, o mesmo projeto certamente pode ser usado para as comunidades mais complexas. Os volumes de amostra e biomassa dentro do EcoFABs são provavelmente mais do que suficiente para uma maior integração com tecnologias de sequenciamento de DNA, que será importante para caracterizar e monitorar a expressão de gene e estrutura de comunidade microbiana.
Em conclusão, este protocolo detalha a fabricação dos ecossistemas de laboratório projetado para a investigação de interações planta-micróbio, com ênfase em métodos simples e acessíveis que pode ser facilmente implementado e estendido por pesquisadores em todo o mundo. Os actuais esforços visam demonstrar a reprodutibilidade entre laboratórios e a integração de um sistema de controle de temperatura, tal que cada EcoFAB vai ter controlados independentemente luz e temperatura. Um avanço adicional do sistema será a integração de amostragem automatizada e o reenchimento de câmaras de raiz EcoFAB e o desenvolvimento de protocolos podem ser reproduzidos para estabelecer microbiomes de planta relevantes dentro de EcoFABs.

A aplicação de micróbios benéficos planta na agricultura oferece grande potencial para aumentar a alimentação sustentável e produção de biocombustíveis para fornecer para uma crescente população1,2,3,4. Uma quantidade significativa de trabalho suporta a importância da planta microbiomes na captação de nutrientes de planta, tolerância a estresses e resistência à doença5,6,7,8. No entanto, é difícil investigar esses mecanismos de interações planta-micróbio em ecossistemas do campo devido à complexidade e reprodutibilidade associada e incapacidade de controlar com precisão a composição microbiome e genética (EG., utilizando microbiana mutantes)4,9,10.
Uma estratégia é construir ecossistemas modelo simplificado para permitir controlada, experimentos de laboratório replicada investigando interações planta-micróbio para gerar ideias que podem ser mais testadas no campo10,11, 12. Este conceito baseia-se em abordagens tradicionais usando plantas cultivadas em vasos com solo cheio ou em placas de ágar dentro de estufas ou incubadoras13. Embora estas provavelmente continuará a ser o mais amplamente utilizado abordagens, falta-lhes a capacidade de precisamente monitorar e manipular os ambientes de crescimento de planta. Para esses fins, rhizoboxes e rhizotrons representam uma grande melhoria na capacidade de estudar processos abaixo do solo14,15, e, primeiros protocolos foram publicados para a análise de metabólitos de rizosfera em solo16. Mais recentemente, para permitir a análise de alto throughput, microfluidic avançados dispositivos13,17 como planta Chip18,19, RootArray20e RootChip21, foram desenvolvido como ferramentas eficientes para fenotipagem de planta com resolução espacial de micrômetro-escala para monitorar os estágios iniciais de crescimento da planta pequena modelo Arabidopsis thaliana no meio de vazão de líquidos. Recentemente, uma plataforma de imagem da dois-camada foi descrita que permite que a raiz do cabelo imaging de Arabidopsis thaliana na fase de plântula com uma plataforma de microfluidic22.
Aqui, protocolos detalhados para a construção de dispositivos controlados de laboratório (EcoFABs) são fornecidos, para estudar as interações micróbio de planta e mostrar que eles podem ser usados para estudar diversas plantas incluindo Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, a aveia selvagem ecologicamente importante Avena barbata e a colheita de bioenergia Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB é uma plataforma de crescimento de planta estéril que inclui dois componentes principais: o dispositivo EcoFAB e recipiente transparente tamanho planta estéril. O dispositivo é feito de um polidimetilsiloxano (PDMS), processo que envolve a carcaça PDMS de fabricação EcoFAB camadas de um molde de plástico impresso 3D e ligação de camadas PDMS para corrediças do microscópio usando métodos anteriormente relatados24,25 . Os procedimentos detalhados de EcoFAB fluxo de trabalho, tais como fabricação de dispositivo, esterilização, germinação de sementes, transplante de mudas, micróbio inoculação/cocultivation, preparação de amostras e análise, são descritos no presente protocolo (Figura 1). Outras modificações de fluxo de trabalho básico são descritas, incluindo a instalação do computador controlado luzes LED crescer e a utilização de substratos sólidos. A utilização de técnicas para investigar a morfologia da raiz de imagem muda, colonização microbiana das raízes, e imagem de massa espectroscópica de exsudados radiculares são descritos. Antecipamos que o design simples, barato, com base em materiais prontamente disponíveis, bem como os protocolos detalhados apresentados aqui, vai transformar a plataforma EcoFAB um recurso da Comunidade, a padronização de estudos de planta-microbiome de laboratório.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printed custom mold</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air duster spray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75780-350</td>
			<td>any compressed gas duster should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 gauge blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89166-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8221;x2&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.75&#34; x 2.56&#34; x 3.56&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005GAQ25Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; x 3 &#188;&#8221; microscope glass slide</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.87&#34; x 4.87&#34; x 5.50&#34; EcoFAB box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00P9QVOS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed custom clamp</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>STL files available from Trent Northen&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>AirClean&#160;Systems</td>
			<td>AC600 Series PCR Workstations</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE syringe tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z117315-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base</td>
			<td>Phytotechnologies Laboratories</td>
			<td>M554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Pro-Mix PGX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71010-52-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-24 Col-4 Columbia wild type</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachypodium distachyon</td>
			<td>LBNL</td>
			<td>Standard Bd-21 line</td>
			<td>Available from John Vogel&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panicum virgatum</td>
			<td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td>
			<td>Alamo switchgrass</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9830-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVAC concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant&#8482; SPD111 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromotography system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1290 LC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive&#8482; Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIMS chip and custom MALDI plate</td>
			<td>LBNL</td>
			<td></td>
			<td>For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI mass spectrometer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-coated LED grow light strip</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-SRB60F010-2835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC420 controller</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0197U7R8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone LED clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00N9X1GI0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B006IY359K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-bare LED connector cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-F05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female-to-male LED connector extension cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>HH-MF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20AWG 2-wire cable</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>6102051TFT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WAGO 221-415 Splicing Connector</td>
			<td>LED World Lighting</td>
			<td>221-415</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecosystem fabrication (ecofab) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions

Interações planta-micróbio benéfico para oferecer uma solução biológica sustentável com o potencial para impulsionar a produção de alimentos e bioenergia de baixo-entrada. Uma melhor compreensão mecanicista dessas interações planta-micróbio complexo será crucial para melhorar a produção vegetal, bem como realizando basic ecológica estuda investigar interações planta-solo-micróbio. Aqui, uma descrição detalhada para fabricação de ecossistema é apresentada, usando tecnologias de impressão 3D amplamente disponíveis, para criar habitats laboratório controlado (EcoFABs) para estudos mecanicistas de interações planta-micróbio dentro específicos ambientais condições. Dois tamanhos de EcoFABs que são adequados para a investigação das interações microbianas com várias espécies de plantas, incluindo Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatumdescritos. Estes dispositivos de passagem permitem controlados manipulação e amostragem de raiz microbiomes, química de raiz, bem como a imagem da raiz morfologia e localização microbiana. Este protocolo inclui os detalhes para a manutenção de condições estéreis dentro EcoFABs e montagem de sistemas de iluminação LED independentes para EcoFABs. Métodos detalhados para adição de diferentes formas de mídia, incluindo os solos, areia e mídia de crescimento líquido acoplado para a caracterização desses sistemas utilizando imagens e metabolomics são descritos. Juntos, estes sistemas permitem a investigação detalhada e dinâmica da planta e planta-microbiana consórcios, incluindo a manipulação de microbiome composição (incluindo mutantes), o acompanhamento do crescimento da planta, morfologia de raiz, composição de exsudato, e Localização de microbiana sob condições ambientais controladas. Nós antecipamos que estes protocolos detalhados servirá como um importante ponto de partida para outros pesquisadores, idealmente, ajudando a criar sistemas experimentais padronizados para investigar interações planta-micróbio.

Cada sistema EcoFAB inclui um dispositivo EcoFAB e uma planta de tamanho de recipiente de plástico transparente. Um dispositivo EcoFAB tem um reservatório de planta, uma câmara de crescimento de raiz, uma entrada de fluxo de 1,6 mm e uma saída de 1,6 mm para dispositivo EcoFAB padrão (Figura 2D & Figura 3 H) ou uma tomada de 10 mm para dispositivo de EcoFAB largo de corrente (Figura 2F & Figura 3I ). O reservatório da usina é projetado em forma de trapézio que possui uma abertura superior de 6 mm e abertura de fundo de 3 mm, e este projeto reduz a possibilidade de vazamento de fluxo durante a injeção de líquido e também garante o espaço suficiente para o crescimento das plantas. A câmara de crescimento de raiz adota uma forma oval com 2 mm de profundidade para caber os sistemas da raiz de muitas plantas de modelo, como mostrado na Figura 2 e E. Canais de entrada e de saída de um dispositivo EcoFAB padrão podem ser conectados com tubo de PTFE para que soluções de nutrientes podem fluir na câmara de crescimento de raiz sem abrir o recipiente EcoFAB. O dispositivo de EcoFAB largo-tomada grandemente reduz a resistência ao fluxo de saída e é usado de preferência quando o cultivo de plantas com sistemas de raiz grossos ou periodicamente coleta exsudados de raiz depois de sistemas complexos de raiz são derivados de plantas.
Os moldes de fundição para a fabricação de camadas PDMS de dispositivos EcoFAB são criados em um software de design e 3D impresso em fotopolímeros opacos rígidos, como mostrado na Figura 2 e Figura 3. Plantas dentro de EcoFABs podem ser diretamente observadas com um microscópio usando uma distância de trabalho longa, garantindo que o estéril cresce ambiente (Figura 8A, Arquivo complementar 1). EcoFAB dispositivos com plantas também podem caber em um palco de microscópio de alta resolução, que permite que imagens de resolução mais elevada de interações planta-micróbio (Figura 8B, Arquivo complementar 2). Esterilidade não é mantida neste ambiente, e imagens de alta resolução, portanto, só é adequada para medições de ponto de extremidade.
EcoFABs são projetados para permitir estudos de sistemática de plantas, tais como a sua morfologia, metabolismo e comunidades microbianas em seus estágios de crescimento diferentes em seus ciclos de vida. Aqui, EcoFABs foram examinados como uma plataforma geral para estudar uma variedade de espécies de plantas. Figura 8 -E mostrar 7 - dias velho Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatum crescendo em EcoFABs. Todas as três plantas foram encontradas crescer bem no EcoFAB para mais de um mês. Tanto a dicot, Arabidopsis thaliana e a botânica, Brachypodium distachyon foram encontrados à altura de seus estágios de reprodução na EcoFABs.
O sistema de vedação reversível permite o uso de substratos sólidos (ex., solo) dentro do EcoFABs (passo 2.2). Este reversível da selagem abordagem permite um carregamento de substratos sólidos em câmaras de crescimento de raiz e também permite a coleta de amostra de regiões específicas de rhizospheres de raiz. Figura 8F -H mostra um grupo de 14 dias de idade Brachypodium distachyon crescendo no meio hydroponic, bem como a areia e solo suplementado com meio hydroponic (areia) e água (solo). A camada fina de substrato sólido em câmaras de crescimento de raiz permite que a luz penetrar para geração de imagens microscópica de sistemas da raiz.
Morfologia da raiz é definida como configuração espacial e a distribuição de um sistema de raiz da planta e foi aprovada como uma resposta de Fisiologia essencial para ambientes de crescimento diversas, tais como nutriente ou água disponibilidade32,33, 34. EcoFABs fornecem uma abordagem conveniente estudar a morfologia vegetal ao longo do tempo ou em diferentes condições de nutrientes. Figura 9A-F mostram um exemplo de usando EcoFABs para acompanhar as morfologias de raiz de Brachypodium distachyon nas primeiras três semanas. Uma muda de Brachypodium distachyon foi transferida para o dispositivo EcoFAB, e sua estrutura de raiz foi gravada por uma câmera dentro de um sistema de imagem de gel BIO-RAD. Programa de processamento de imagem, como imagem J, python e matlab, pode ser mais aplicado para quantificar as alterações de morfologias raiz ao longo do tempo ou em diferentes ambientes de médio. A quantificação da área total da raiz ao longo de três semanas, mostrou um aumento gradual da fase inicial (< 1 semana) seguido por uma tendência de crescimento linear ao fim de três semanas, como mostrado na Figura 9.
A principal motivação para construir o EcoFAB é investigar interações planta-micróbio. Conforme descrito na etapa 5.4, microorganismos são transferidos para câmaras de crescimento de raiz da EcoFAB dispositivos através do canal de entrada. A Figura 10 mostra, um EcoFAB contendo simea Pseudomonas (anteriormentefluorescens) WCS417 (WCS417), um crescimento de planta promovendo rizobactérias com rótulos quimioluminescente, foi adicionado para os sistemas de raiz da planta com uma concentração de 106 células por planta. O sinal de WCS417 foi detectado com um Imageador de gel, que indicou uma distribuição espacial distinta dos micróbios WCS417 em câmaras de crescimento de raiz. Em ambos os MS meio líquido com e sem o substrato sólido areia, WCS417 micróbios colonizaram as superfícies dos sistemas da raiz inteiras com micróbios concentrados-se em torno das áreas de ponta de raiz, possivelmente devido à produção de nutriente ativa de dicas de raiz (Figura 10 & H)35. Por outro lado, os micróbios WCS417 em substrato de solo acumularam em torno da região do reservatório de planta em vez de dicas de raiz (Figura 10eu). Como os micróbios foram adicionados através do canal de saída, os micróbios também foram capazes de mover-se ao substrato de solo, mas não se acumulam na raiz, como observado em meio líquido, com ou sem areia. Isso pode indicar que o solo é uma fonte de nutrientes suficiente, e os micróbios migraram para o reservatório de planta para as condições de respiração ideal.
Para estudar metabólito perfilação de exsudados de raiz da planta, bem como a captação de metabólito e liberte das interações planta-micróbio, as soluções de exsudato das câmaras de crescimento de raiz foi coletada através de vários estágios de crescimento das plantas em EcoFABs. Conforme descrito na etapa 6, amostras do exsudato então são extraídas para a análise de LC-MS. Usando este método, uma variedade de metabólitos exalava pela planta e consumido pelos micróbios foi detectada, e o perfil de metabólito relacionado de exsudados radiculares com e sem colonização micróbios é atualmente sob investigação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho The EcoFAB. Plantas são germinadas na placa e transferidas para o EcoFAB esterilizado, os micróbios podem ser adicionados. Amostragem não-destrutiva: exsudados de raiz podem ser amostrados e fotografados, e morfologia da raiz pode ser visualizada. Amostragem destrutiva permite a análise de micróbio, raiz e atirar parâmetros em detalhe.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figura 2: componentes do 3D impresso moldes para a fabricação de dispositivo EcoFAB. (A) superiores e inclinadas vistas de um quadro de fundição. (B) superiores e inclinadas vistas de uma inserção. (C) superior e vistas inclinadas sobre uma base de molde padrão. (E) superiores e inclinadas vistas de uma base de tomada de todo o molde. (D, F) Moldes montados para fabricar dispositivos de EcoFAB padrão e a escala de corrente, respectivamente. As dimensões ovais são 51 x 34 mm para o pequeno EcoFAB molde e 76 mm x 62 mm para grandes EcoFAB molde. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figura 3: fabricação de dispositivo EcoFAB. (A) despejar a mistura do agente de cura e base de elastômero no molde. (B) aquecimento do molde com uma mistura a 85 ° C por 4 h. (C) remover a inserção do molde. (D) separando o PDMS da armação da carcaça. (E) empurrando o molde base fora do quadro de fundição. (F) usando uma faca para separar o molde ao longo das bordas do PDMS. (G) a camada PDMS lentamente fora da base de molde a descascar. Buracos de Poking (H) para os canais de entrada e a saída da camada padrão de PDMS. (I) cutucando um buraco para o canal de entrada da camada de PDMS largo-tomada. Camada (J) o PDMS (feitas de um elastômero de 15:1 base para mistura de agente de cura) e uma lâmina de microscópio são lavadas e transferidas para um plasma líquido de limpeza para colagem. (K) usando os grampos para prender a camada PDMS (feita de uma base de elastômero de 5:1 a mistura do agente de cura) numa lâmina de microscópio. (L) pressionando a camada PDMS (feita de uma base de elastômero de 30: 1 a mistura do agente de cura) diretamente para uma lâmina de microscópio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figura 4: O design de braçadeiras personalizados. (A) superiores e inclinadas vistas do topo de uma braçadeira placa. (B) superiores e inclinadas vistas sobre um fundo fixar placa. (C) superior e inclinadas vistas do grampo montado com quatro conjuntos de parafusos hexagonais. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figura 5: instalar LED crescer luzes. (A) marcação fora os locais para 9 clipes de LED em uma espiral em torno do recipiente EcoFAB. (B) LED clipes anexado ao contêiner EcoFAB. (C) threading uma tira de LED por esses clipes. (D) regueta o LED a um controlador com fio com uma fonte de alimentação de 24V. (E) o esquema de ligações dos fios para o controlador. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figura 6: transferência de mudas para EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon plantas cultivadas há 2 dias em um prato de 0,5 MS. (B) enchendo a câmara de raiz com média de crescimento de planta. (C) usando uma pinça para inserir a raiz cuidadosamente o reservatório da usina. (D) selar o recipiente EcoFAB com fita micropore, depois de adicionar 3 mL de água para o fundo do recipiente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figura 7: imagem NIMS da planta raízes no EcoFABs. (A) um Brachypodium distachyon crescendo em um EcoFAB estéril. (B) anexar a camada PDMS com a planta em uma microplaqueta NIMS por 20 min. (C) usando cobre fita colocar o chip de NIMS em uma placa personalizada de MALDI e carregá-los em um espectrômetro de massa MALDI. (D-G) um 7 - velho dia e um 20 dia de idade Brachypodium distachyon planta usada para NIMS imaging (D, E) e as imagens correspondentes do NIMS (F, G). Os íons predominantes foram destacados em vermelho, verde e azul. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figura 8: as aplicações gerais de EcoFABs. (A) diretamente capturando o crescimento da raiz de Brachypodium distachyon em um EcoFAB com uma configuração de microscópio de distância longa do trabalho. (B) diretamente, observando interações micróbio de raiz com uma configuração de alta resolução do microscópio. (C-E) 7 - dias velho Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) e Panicum virgatum (E) no meio hydroponic 0,5 MS, 14 dias de idade (F-H) Brachypodium distachyon cultivadas em hidroponia 0,5 MS (F), em areia (G) e solo (H) substrato fornecido com média de 0,5 MS e água, respectivamente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figura 9: usando EcoFABs para estudar a morfologia da raiz. (A-F) Desenvolvimento de raiz de Brachypodium distachyon crescendo em EcoFABs preenchido com média de 0,5 MS durante as primeiras três semanas: (A) há 2 dias, (B) 4, (C) 7 dias, (D) 11, e 14 dias, (F) 21 dias de crescimento. (G) áreas de superfície de raiz em média foram estimadas pelo software ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figura 10: usando EcoFABs para estudar interações de raiz-micróbio. (A, B, C) Um grupo de 15 dias de idade Brachypodium distachyon colonizar com Pseudomonas fluorescens WCS417 em diferentes formas de mídia-MS líquidos substratos de solução, areia e solo. (D, E, F) Fotos de campo brilhante de seus sistemas da raiz. (G, H, EU) As correspondentes imagens quimioluminescente destes sistemas de raiz após cultivo co 14 dias. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar arquivo 1. Usando EcoFAB para capturar o crescimento da raiz. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar arquivo 2. Usando EcoFAB para capturar as interações de raiz-micróbios. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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