Name: detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

وأيد المنح البحثية وأيده DK52057 و DK107498 من المعاهد الوطنية للصحة إلى K.V.K. X.P 2T32DK007201 منحة التدريب المؤسسي من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل.

1-تناول الببتيد
<ol><li>تصميم وترتيب الببتيد<ol>
<li>اختر التسلسل المطلوب من الببتيد، وإضافة علامة، مثل حركة حانمه (اقكليسيد) في أما ن-أو ج-نهايته.</li>
		<li>التحقق من قابلية الذوبان المتوقع من الببتيد في الماء، واستخدام http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php آلة حاسبة الذوبان الببتيد. إذا كان منخفضا الذوبان?...

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

سورتيلين هو مستقبلات بروتين يجند متعدد مصانة تطورية التي تشارك في كل إشارة في غشاء البلازما وفي داخل الخلية فرز الأحداث6،7. ومع ذلك، البحث عن يغاندس في سورتيلين أصيلة (بعضها من البروتينات الغشاء لومينال أو لا يتجزأ) معقد كما يظهر تفاعل سورتيلين مع بعض شركائه...

هو GLUT4 بروتين الناقل جلوكوز التي يعبر عنها غالباً في خلايا العضلات والدهون والهيكل العظمى حيث أنه يتوسط تأثير الأنسولين على إزالة جلوكوز الدم بعد prandial1. يجري بروتين مستقرة جداً، وينظم GLUT4 عند مستوى بوستترانسلاشونال. نظراً لغياب الأنسولين، GLUT4 مستبعد إلى حد كبير من غشاء البلازما (ومن ثم انخفاض نفاذية القاعدية الجلوكوز) وهو مترجم أساسا داخل الخلية في حويصلات تستجيب للأنسولين الصغيرة (إيرفس) وشبكة ترانس-غولجي (TGN) التي من المحتمل أن تمثل حجرة المانحة ايرف. لدى الإدارة الأنسولين، إيرفس الصمامات مع غشاء البلازما وتسليم GLUT4 إلى موقع عمله. وهذا يزيد من نفاذية غشاء البلازما للسكر، حيث أن امتصاص الجلوكوز من الدم في adipocytes والهيكل العظمى myocytes يرتفع 10 إلى ضعفا. بعد سحب الأنسولين، مستوعبة في اندوسوميس المبكر/الفرز GLUT4 واستعادتها ثم إلى TGN حيث إيرفس إعادة تشكيل. فرز كل الخطوات في المسار GLUT4 واسترجاع أي من اندوسوميس المبكر الطرفية إلى بيرينوكلير TGN وتشكيل إيرفس على الجهة المانحة TGN الأغشية هي تمكين أفراد الأسرة Vps10p، سورتيلين، الذي يمثل نوع أنا بروتين ترانسميمبراني ومستقبل فرز. ووفقا لنموذج واحد، يعمل سورتيلين بروتين سقالة transmembrane: يربط GLUT4 في التجويف اندوسوميس و TGN، والمجندين محولات ريترومير أو كلاثرين إلى جانب هيولى المانحين الغشاء عن طريق المحطة ج2، 3-وهذا يسهل توزيع GLUT4 إلى الناقلين حويصلية ترانسلوكاتي GLUT4 بين الأقسام داخل الخلايا.
التفاعل بين هيولى ذيل سورتيلين مع ريترومير ومختلف البروتينات محول توثيقاً جيدا. ومع ذلك، قد تم تحدي ربط سورتيلين إلى GLUT4 (والعديد من أن يغاندس البروتين الأخرى) لإثبات. على وجه الخصوص، محاولات لشركة إيمونوبريسيبيتاتي سورتيلين و GLUT4 لم تنجح ربما بسبب طبيعة التفاعل بين هذه البروتينات هما المراعية للمنظفات. وبالإضافة إلى ذلك، بروتين الناقل نموذجي، قد GLUT4 مجالات transmembrane 12 و 6 حلقات لومينال أية تركيبة من التي يحتمل أن تكون قد تمثل موقع سورتيلين-ملزمة. في الوقت نفسه، تقترح مجموعة كبيرة من الأدلة غير المباشرة، مثل كبير التعريب المشارك في الخلية، العابرة للربط مع نفاذية الغشاء حزب اليسار الديمقراطي، والتفاعل في نظام هجين اثنين الخميرة يمكن ربط هذا سورتيلين إلى GLUT4. وعلاوة على ذلك، باستخدام هذا النهج الأخير في تركيبة مع ألانين مسح الطفرات، سابقا قررنا أن المجال Vps10p من سورتيلين بربط أساسا الحلقة الأولى لومينال من GLUT4. بيد أن الدليل على مثل هذا التفاعل في خلايا الثدييات كان مفقوداً. هنا، نحن قد عزلت سورتيلين صاحب معلم من الخلايا transfected 3T3-L1 استخدام الراتنج الكوبالت، وأثبتت أنها يمكن أن تتفاعل مع الببتيد مركباً كيميائيا المقابلة للحلقة الأولى لومينال من GLUT4 على درجة الحموضة 6 ودرجة الحموضة 8 التي تشبه الوسط الحمضي في اندوسومال التجويف وبيئة محايدة في التجويف الأغشية TGN. تم الكشف عن لا ربط الببتيد في تجارب التحكم حيث تم تحميل استخراج إعداد من الخلايا غير ترانسفيكتيد على نفس الخرز.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td style="width:167px;">for use in purification of histidine tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mL Insulin Syringe U-100</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329652</td>
			<td style="width:167px;">26G x 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:107px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">23228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-234</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HisPur Cobalt Resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">89964</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tricine sample Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0739</td>
			<td style="width:167px;">with SDS, bMercaptaethanol should be added</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Elution&#160; Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-236</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-3115</td>
			<td style="width:167px;">For seperation of peptide and small protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris/Tricine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transfer Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-190</td>
			<td style="width:167px;">Add 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrocellulose membrane&#160; 0.45 mm</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;">BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti Myc antibody</td>
			<td style="width:107px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2272</td>
			<td style="width:167px;">Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide</td>
			<td style="width:107px;">Genscipt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>customize ordering</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precision Plus Protein Dual color Standarts</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

أن قدرتنا على استكشاف تفاعلات البروتين البروتين هو المفتاح لفهم الاتصالات التنظيمية في الخلية. ومع ذلك، الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في كثير من الحالات يرتبط مع تحديات تجريبية كبيرة. على وجه الخصوص، الفرز مستقبلات تتفاعل مع حمولتها البروتين في التجويف المقصورات الغشاء غالباً بطريقة حساسة للمنظفات، مما يجعل co-إيمونوبريسيبيتيشن من هذه البروتينات غير قابلة للاستخدام. ملزمة من سورتيلين مستقبلات الفرز لنقل الجلوكوز GLUT4 قد تخدم كمثال على ضعف تفاعلات البروتينات الغشاء لومينال. وهنا يصف لنا مقايسة سريعة وبسيطة وغير مكلفة للتحقق من صحة التفاعل بين سورتيلين و GLUT4. لذلك، قمنا بتصميم وتصنيعه كيميائيا الببتيد معلم حركة المقابلة حانمه ملزمة سورتيلين المحتملة في الجزء لومينال من GLUT4. سورتيلين المفتاحية هيستيدينيس ست المعرب عنها في خلايا الثدييات، ومعزولة عن ليساتيس الخلية باستخدام قشور حبات. سورتيلين المعطل تداولها على الخرز كان المحتضنة مع الحل الببتيد في قيم الأس الهيدروجيني مختلفة، وكان تحليل المواد الوتيد بواسطة النشاف الغربية. هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لدراسة تفاعلات أخرى حساسة للمنظفات البروتين-بروتين.

أعدت ليساتيس من 3T3 الخلايا L1 ستابلي transfected مع سورتيلين-حركة/صاحب5 ومن وزن 3T3 L1 الخلايا، واستخدامها كعنصر سلبي. كلا ليساتيس المحتضنة مع قشور حبات على درجة الحموضة 6 أو 8 درجة الحموضة وغسلها جيدا. ثم كانت المحتضنة الخرز مع البروتينات المعطل تداولها في حل حركة-fll-Glut...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

يصف لنا بروتوكول للكشف عن المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء استخدام ربط لمستقبلات الفرز، سورتيلين، إلى حلقة لومينال الأولى من البروتين الناقل الجلوكوز، GLUT4، على سبيل مثال.

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

قياس التفاعلات بين مجسات الفلورسنت والليغسين في أقسام النبات بواسطة sFLIM استنادا إلى الفلورية الاصليه

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support