Name: detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger DK52057 og DK107498 fra NIH til K.V.K. X.P blev støttet af den institutionelle uddannelse grant 2T32DK007201 fra NIH.

1. håndtering af peptid
<ol><li>Design og bestilling af peptid<ol>
<li>Vælg den ønskede sekvens af peptid, og tilføje et mærke, som myc epitop (EQKLISEED) på sin enten N - eller C-terminus.</li>
		<li>Tjek den forudsagte opløseligheden af peptid i vand, ved hjælp af peptid opløselighed lommeregner http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Hvis opløseligheden er lav, prøve at tilføje en anden vandopløselige tag for at ændre afgift balancen. Bemærk: Vi brugte peptid svarende til den første ...

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

Sortilin er en evolutionær bevarede multi ligand protein receptor, der er involveret i begge signalering på plasma membran og intracellulære sortering begivenheder6,7. Søg efter den autentiske sortilin ligander (hvoraf nogle er luminale eller integreret membranproteiner) er imidlertid komplicerede som samspillet mellem sortilin og nogle af dets bindende partnere synes at være følsomme over for vaske-og rengøringsmidler. Derfor, en let og en udbredt metode ...

GLUT4 er en glucose transporter protein, som er udtrykt overvejende i fedt og skeletmuskulatur celler hvor det medierer effekten af insulin på post prandial blod glukose clearance1. At være en meget stabil protein, er GLUT4 reguleret på en posttranslationelle niveau. I mangel af insulin, GLUT4 er stort set udelukket fra plasma membran (dermed lav basal permeabilitet for glukose) og er lokaliseret hovedsageligt inde i cellen i små insulin-responderende vesikler (IRVs) og trans-Golgi netværk (TGN), der er tilbøjelige til at repræsentere IRV donor rum. Efter insulin administration, IRVs fuse med plasma membran og levere GLUT4 til webstedet fungerer. Dette øger permeabilitet af plasma membran for glukose, så at glukoseoptagelse fra blodet ind i adipocytter og skelet myocytes stiger 10 til 40-fold. Efter insulin tilbagetrækning, er GLUT4 internaliseret i begyndelsen/sortering endosomes og derefter hentes til TGN hvor IRVs er igen dannet. Begge sortering trin i GLUT4 pathway, dvs hentning fra de perifere tidlige endosomes til perinuclear TGN og dannelsen af IRVs på TGN donor membraner er aktiveret af Vps10p familiemedlem, sortilin, som repræsenterer en type jeg transmembrane protein og en sortering receptor. Efter en model, sortilin virker som en transmembrane stillads protein: det binder GLUT4 i lumen af endosomes og TGN og rekrutter retromer eller clathrin adaptere til den cytoplasmatiske side af donor membran via sine C-terminus2, 3. Dette letter fordelingen af GLUT4 i vesikulære luftfartsselskaber, der translocate GLUT4 mellem intracellulære rum.
Samspillet mellem den cytoplasmatisk hale af sortilin og retromer og forskellige adapter proteiner har været veldokumenteret. Men bindingen af sortilin til GLUT4 (og flere af sine andre protein ligander) har været udfordrende for at bevise. Forsøg på at co-immunoprecipitate sortilin og GLUT4 har især ikke været vellykket sandsynligvis på grund af samspillet mellem disse to proteiner vaskemiddel-følsomme karakter. GLUT4 har desuden som en typisk transporter protein, 12 transmembrane domæner og 6 luminale sløjfer enhver kombination heraf kan potentielt repræsentere en sortilin bindingssted. På samme tid, en stor mængde af indirekte beviser, som væsentlig fælles lokalisering i cellen, cross-linking med membran-gennemtrængelige DSP og samspillet i gær to hybridsystem tyder på, at sortilin kan bindes til GLUT4. Derudover konstateret benytter metoden med sidstnævnte i en kombination med alanin scanning mutagenese, vi tidligere, at domænet Vps10p af sortilin binder primært til den første luminale loop af GLUT4. Imidlertid har bevis på sådan en interaktion i pattedyrceller manglet. Her, vi har isoleret hans-mærket sortilin fra transfekteret 3T3-L1 celler ved hjælp af kobolt harpiks og demonstreret, at det kan interagere med kemisk syntetiseret peptid svarende til den første luminale loop af GLUT4 på pH 6 og pH 8, der ligner sure miljø i den endosomal lumen og neutral miljø i lumen af TGN membraner. Ingen peptid bindende blev opdaget i kontrol eksperimenter hvor ekstrakt fremstillet af ikke-transfekteret celler blev indlæst på de samme perler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td style="width:167px;">for use in purification of histidine tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mL Insulin Syringe U-100</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329652</td>
			<td style="width:167px;">26G x 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:107px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">23228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-234</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HisPur Cobalt Resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">89964</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tricine sample Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0739</td>
			<td style="width:167px;">with SDS, bMercaptaethanol should be added</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Elution&#160; Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-236</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-3115</td>
			<td style="width:167px;">For seperation of peptide and small protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris/Tricine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transfer Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-190</td>
			<td style="width:167px;">Add 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrocellulose membrane&#160; 0.45 mm</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;">BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti Myc antibody</td>
			<td style="width:107px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2272</td>
			<td style="width:167px;">Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide</td>
			<td style="width:107px;">Genscipt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>customize ordering</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precision Plus Protein Dual color Standarts</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

Vores evne til at udforske protein-protein interaktioner er nøglen til at forstå lovgivningsmæssige forbindelser i cellen. Påvisning af protein-protein interaktioner i mange tilfælde er imidlertid forbundet med betydelig eksperimentelle udfordringer. Især interagere sortering receptorer med deres protein last i lumen af membran rum ofte i et vaskemiddel-følsomme mode, at co-immunoprecipitation af disse proteiner ubrugelige. Binding af den sortering receptor sortilin til glukose transporter GLUT4 kan tjene som et eksempel på svage luminale interaktioner mellem Membranproteiner. Her beskriver vi en hurtig, enkel og billig assay for at validere samspillet mellem sortilin og GLUT4. For det, har vi designet og kemisk syntetiseret myc-tagged peptid svarende til den potentielle sortilin-bindende epitop i den luminale del af GLUT4. Sortilin markeret med seks histidiner var udtrykt i pattedyrceller, og isoleret fra cellelysater ved hjælp af kobolt perler. Sortilin immobiliseret på perlerne var inkuberes med peptid løsning på forskellige pH-værdier, og det eluted materiale blev analyseret af Western blotting. Denne analyse kan være let tilpasses til at studere andre vaskemiddel-følsomme protein-protein interaktioner.

Lysates blev udarbejdet fra 3T3 L1 celler stabilt transfekteret med Sortilin-myc/hans5 og fra WT 3T3 L1 celler, bruges som en negativ kontrol. Begge lysates blev inkuberet med kobolt perler på pH 6 eller pH 8 og grundigt vasket. Perler med immobiliserede proteiner blev derefter inkuberes i løsningen af Myc-fll-Glut4. Efter omhyggelig vasker, blev proteiner bundet til perlerne elueret med 0,25 M imidazol. Prøverne blev udsat, sammen med den oprindelige lysates ti...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Vi beskriver en protokol til påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner med binding af den sortering receptor, sortilin, til den første luminale loop af glucose transporter protein, GLUT4, som eksempel.

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måling af interaktioner mellem fluorescerende sonder og lignin i plante sektioner af sFLIM baseret på naturlig Auto Luorescens

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for kvantitativ bestemmelse af palmitoyllation af hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support