Name: detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door DK52057 en DK107498 van de NIH naar KvK X.P werd gesteund door de institutionele opleiding-subsidie 2T32DK007201 van de NIH onderzoekssubsidies.

1. het hanteren van de Peptide
<ol><li>Ontwerpen en bestellen van de peptide<ol>
<li>Kies de gewenste volgorde van de peptide en toevoegen van een tag, zoals myc epitope (EQKLISEED) op haar beide N - of C-terminus.</li>
		<li>Controleer de voorspelde oplosbaarheid van de peptide in water, met behulp van peptide oplosbaarheid rekenmachine http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Als de oplosbaarheid laag is, probeert toe te voegen een andere in water oplosbare tag als de balans van de kosten wilt wijzigen.<...

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

Sortilin is een evolutionaire Geconserveerde proteïne van de multi ligand-receptor die betrokken is in beide signalering op het plasma-membraan en intracellulaire Sorteer gebeurtenissen6,7. De zoektocht naar de authentieke sortilin liganden (waarvan sommige zijn luminal of integraal membraaneiwitten) is echter ingewikkeld als de interactie van sortilin met een aantal van haar partners bindende lijkt te zijn gevoelig voor detergentia. Daarom een eenvoudig en een ...

GLUT4 is een glucose transporter proteïne die overwegend wordt uitgedrukt in vet en skeletale spiercellen, waar het het effect van de insuline op postprandiale bloed glucose goedkeuring1bemiddelt. Wordt een zeer stabiele eiwitten, is GLUT4 op een posttranslationele niveau geregeld. Bij gebrek aan insuline, GLUT4 is grotendeels uitgesloten uit het plasma-membraan (vandaar lage basale permeabiliteit voor glucose) en is gelokaliseerd vooral binnen de cel in kleine insuline-responsieve blaasjes (IRVs) en trans-Golgi network (TGN) die dreigt te vertegenwoordigen de IRV donor compartiment. Op insuline toediening, de IRVs zekering met het plasma-membraan en GLUT4 leveren op de site van de werking ervan. Dit verhoogt de permeabiliteit van het plasma-membraan voor glucose, zodat dat glucose-opname uit bloed in adipocytes en skeletale myocytes 10 tot 40-fold stijgt. Na de terugtrekking van de insuline, is GLUT4 geïnternaliseerd in vroege/sorteren Endosomen en vervolgens opgehaald voor TGN waar de IRVs zich opnieuw gevormd. Beide sorteren stappen in het GLUT4 traject, d.w.z. wegnemen uit de perifere vroege Endosomen tot het perinuclear TGN, en de vorming van de IRVs op de TGN donor membranen zijn ingeschakeld door een familielid van Vps10p, sortilin, die een type vertegenwoordigt I transmembraan eiwit en een sorteer receptor. Volgens één model, sortilin werkt als een transmembraan steiger eiwit: het GLUT4 in het lumen van de Endosomen en TGN bindt, en werft adapters van de retromer of clathrin naar de cytoplasmatische kant van de donor membraan via haar C-terminus2, 3. Dit vergemakkelijkt de verdeling van de GLUT4 in vesiculaire dragers die GLUT4 tussen de intracellulaire compartimenten translocate.
De interactie van de cytoplasmatische staart van sortilin met retromer en verschillende adaptor eiwitten is goed gedocumenteerd. Echter, de binding van sortilin naar GLUT4 (en op een aantal van haar andere proteïne liganden) heeft zijn uitdagend om te bewijzen. In het bijzonder, pogingen om te co-immunoprecipitate sortilin en GLUT4 niet gelukt waarschijnlijk te wijten aan het wasmiddel-gevoelige aard van de interactie tussen deze twee eiwitten. Bovendien, als een typische transporter proteïne, heeft GLUT4 12 transmembraan domeinen en 6 luminal loops elke mogelijke combinatie van die potentieel een sortilin-bindende site vertegenwoordigen kan. Op hetzelfde moment, een grote hoeveelheid indirect bewijs, zoals aanzienlijke co lokalisatie in de cel, dwarsbinding met membraan-permeabele DSP, en de interactie in gist twee hybridesysteem suggereren dat sortilin kan binden aan de GLUT4. Bovendien hebben gebruikt de laatste benadering in een combinatie met de alanine scannen mutagenese, wij eerder vastgesteld dat het domein van de Vps10p van sortilin voornamelijk aan de eerste luminal lus van GLUT4 bindt. Echter, het bewijs van een dergelijke interactie in zoogdiercellen heeft ontbroken. Hier hebben we geïsoleerd zijn-gelabeld sortilin uit cellen transfected 3T3-L1 met behulp van kobalt hars en aangetoond dat kan communiceren met chemisch gesynthetiseerde peptide overeenkomt met de eerste luminal lus van GLUT4 bij pH 6 en pH 8 die lijken op zure milieu in de endosomal lumen en neutrale omgeving in het lumen van de TGN membranen. Geen bindend peptide werd ontdekt in controle experimenten waar uittreksel bereid uit niet-transfected cellen was geladen op de dezelfde parels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td style="width:167px;">for use in purification of histidine tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mL Insulin Syringe U-100</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329652</td>
			<td style="width:167px;">26G x 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:107px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">23228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-234</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HisPur Cobalt Resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">89964</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tricine sample Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0739</td>
			<td style="width:167px;">with SDS, bMercaptaethanol should be added</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Elution&#160; Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-236</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-3115</td>
			<td style="width:167px;">For seperation of peptide and small protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris/Tricine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transfer Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-190</td>
			<td style="width:167px;">Add 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrocellulose membrane&#160; 0.45 mm</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;">BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti Myc antibody</td>
			<td style="width:107px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2272</td>
			<td style="width:167px;">Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide</td>
			<td style="width:107px;">Genscipt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>customize ordering</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precision Plus Protein Dual color Standarts</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

Ons vermogen om te verkennen van eiwit-eiwitinteractie is de sleutel tot het begrijpen van regelgevende verbindingen in de cel. Detectie van eiwit-eiwitinteractie in veel gevallen is echter geassocieerd met significante experimentele uitdagingen. In het bijzonder, interageren Sorteer receptoren met hun lading van de eiwitten in het lumen van het membraan compartimenten vaak in een wasmiddel-gevoelige mode, waardoor co-immunoprecipitation van deze proteïnen onbruikbaar. Binding van het sorteren receptor sortilin aan glucose transporter die glut4 als een voorbeeld van zwakke luminal interacties tussen membraaneiwitten dienen kan. Hier beschrijven we een snelle, eenvoudige en goedkope assay voor het valideren van de interactie tussen sortilin en GLUT4. Wij hebben daarvoor ontworpen en chemisch gesynthetiseerd het myc-gelabeld peptide overeenkomt met de potentiële sortilin-bindende epitoop in het luminal deel van GLUT4. Gelabeld met zes histidines Sortilin was uitgedrukt in zoogdiercellen en geïsoleerd van cel lysates met behulp van kobalt kralen. Sortilin geïmmobiliseerd op de parels was geïncubeerd met de peptide oplossing bij verschillende pH-waarden, en het eluted materiaal werd geanalyseerd door het westelijke bevlekken. Deze test kan gemakkelijk aangepast worden aan andere wasmiddel-gevoelige eiwit-eiwitinteractie te bestuderen.

Lysates waren bereid uit 3T3 L1 cellen transfected stabiel met Sortilin-myc/zijn5 en uit WT 3T3 L1 cellen, gebruikt als een negatieve controle. Beide lysates werden geïncubeerd met kobalt kralen op pH 6 of pH 8 en grondig gewassen. Kralen met geïmmobiliseerdet eiwitten werden vervolgens geïncubeerd in de oplossing van Myc-fll-Glut4. Na voorzichtig wast, werden eiwitten gebonden aan de parels geëlueerd met 0,25 M imidazool. Monsters werden blootgesteld, samen me...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Meten van interacties tussen fluorescentie sondes en lignine in plantendelen door sFLIM op basis van inheemse Autofluorescentie

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning