Name: detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni di ricerca DK52057 e DK107498 dal NIH per Carolina X.P è stata sostenuta dalla formazione istituzionale grant 2T32DK007201 da NIH.

1. movimentazione del Peptide
<ol><li>Progettazione e ordinazione del peptide<ol>
<li>Scegliere la sequenza desiderata del peptide e aggiungere un tag, ad esempio myc epitopo (EQKLISEED) presso suo entrambi N - o C-terminus.</li>
		<li>Controllare la solubilità prevista del peptide in acqua, usando peptide solubilità calcolatrice http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se la solubilità è basso, provare ad aggiungere un altro tag solubile in acqua per cambiare il bilanciamento di carica. Nota: Abbia...

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

Sortilina è un recettore di evolutiva conservata multi-ligando proteina che è coinvolta in entrambi segnalazione alla membrana del plasma e intracellulare ordinamento eventi6,7. Tuttavia, la ricerca di ligandi di sortilina autentico (alcuni dei quali sono proteine di membrana luminale o integrale) è complicata come l'interazione di sortilina con alcuni dei suoi partner di associazione sembra essere sensibili ai detersivi. Di conseguenza, un facile e un approcc...

GLUT4 è una proteina del trasportatore del glucosio che si esprime principalmente in cellule di grasso e muscolo scheletrico dove media l'effetto dell'insulina, il glucosio post-prandiale sangue liquidazione1. Essendo una proteina molto stabile, GLUT4 è regolamentata a livello post-traduzionale. In assenza di insulina, GLUT4 è in gran parte esclusi dalla membrana plasmatica (quindi bassa permeabilità basale per glucosio) ed è localizzata principalmente all'interno della cellula in piccole vescicole insulina-sensible a reagire (IRVs) e trans-Golgi network (TGN) che rischia di rappresentare il vano di donatore IRV. Somministrazione di insulina, il IRVs si fondono con la membrana plasmatica e consegnare GLUT4 al sito del suo funzionamento. Questo aumenta la permeabilità della membrana del plasma per il glucosio, in modo che l'assorbimento di glucosio dal sangue in adipociti e miociti scheletrici aumenta 10 a 40 volte. Dopo il ritiro di insulina, GLUT4 è interiorizzato in endosomi precoce/ordinamento e quindi estratto a TGN dove il IRVs sono ri-formata. Sia l'ordinamento passi nel pathway di GLUT4, cioè recupero dall'endosomi precoce periferici ad perinucleare TGN e la formazione del IRVs sul donatore TGN membrane sono abilitate per il membro della famiglia Vps10p, sortilina, che rappresenta un tipo la proteina del transmembrane e un recettore ordinamento. Secondo un modello, sortilina funziona come una proteina transmembrana impalcatura: si lega GLUT4 in lumen del endosomi e TGN e reclute retromer o clatrina adattatori al lato citoplasmico del donatore membrana tramite suo C-terminus2, 3. questo facilita la distribuzione di GLUT4 in vettori vescicolari che traslocano GLUT4 tra compartimenti intracellulari.
L'interazione della coda citoplasmatica di sortilina con retromer e varie proteine adattatrici è stata ben documentata. Tuttavia, l'associazione di sortilina per GLUT4 (e molti dei suoi altri ligandi di proteina) è stato impegnativo per dimostrare. In particolare, i tentativi di co-immunoprecipitate sortilina e GLUT4 non hanno avuto successo probabilmente a causa della natura sensibile detergente dell'interazione tra queste due proteine. Inoltre, come una proteina di trasporto tipico, GLUT4 ha 12 domini transmembrane e 6 anelli di luminal qualsiasi combinazione di cui potenzialmente può rappresentare un luogo sortilina-legante. Allo stesso tempo, un grande corpo di prova indiretta, ad esempio la sostanziale co-localizzazione nella cella, cross-linking con membrana permeabile DSP e l'interazione in due sistema ibrido del lievito suggeriscono che sortilina può associare a GLUT4. Inoltre, utilizzando l'approccio di quest'ultimo in combinazione con l'alanina scansione mutagenesi, precedentemente abbiamo determinato che il dominio di Vps10p di sortilina lega principalmente per il primo ciclo di luminal di GLUT4. Tuttavia, la prova di tale interazione in cellule di mammifero è scomparso. Qui, abbiamo isolato sortilina His-tag da cellule trasfettate 3T3-L1 con la resina cobalto e ha dimostrato che può interagire con peptide sintetizzato chimicamente corrispondente per il primo ciclo di luminal di GLUT4 pH 6 e pH 8 simile milieu acide nella endosomal lumen e ambiente neutro nel lume delle membrane TGN. Nessuna associazione di peptide è stata rilevata in esperimenti di controllo cui estratto preparato da cellule trasfettate con non è stato caricato sui branelli stessi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td style="width:167px;">for use in purification of histidine tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mL Insulin Syringe U-100</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329652</td>
			<td style="width:167px;">26G x 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:107px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">23228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-234</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HisPur Cobalt Resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">89964</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tricine sample Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0739</td>
			<td style="width:167px;">with SDS, bMercaptaethanol should be added</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Elution&#160; Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-236</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-3115</td>
			<td style="width:167px;">For seperation of peptide and small protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris/Tricine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transfer Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-190</td>
			<td style="width:167px;">Add 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrocellulose membrane&#160; 0.45 mm</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;">BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti Myc antibody</td>
			<td style="width:107px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2272</td>
			<td style="width:167px;">Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide</td>
			<td style="width:107px;">Genscipt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>customize ordering</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precision Plus Protein Dual color Standarts</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

La nostra capacità di esplorare le interazioni proteina-proteina è la chiave per comprendere collegamenti normativi nella cella. Tuttavia, rilevamento delle interazioni proteina-proteina in molti casi è associata con sfide sperimentali significative. In particolare, smistamento recettori interagiscono con il loro carico di proteine nel lume dei compartimenti di membrana spesso in maniera sensibile detergente, rendendo inutilizzabile la co-immunoprecipitazione di queste proteine. Associazione dell'ordinamento sortilina recettore al trasportatore di glucosio che GLUT4 può servire come un esempio di Luminale deboli interazioni tra proteine di membrana. Qui, descriviamo un test veloce, semplice e poco costoso per convalidare l'interazione tra sortilina e GLUT4. Per questo, abbiamo progettato e sintetizzato chimicamente il peptide myc-tagged corrispondente per l'epitopo sortilina-associazione potenziale nella parte luminale di GLUT4. Sortilina taggato con sei istidine è stato espresso in cellule di mammifero e isolato da lisati cellulari usando le perle di cobalto. Sortilina immobilizzata sulle perle è stato incubato con la soluzione del peptide a valori di pH diversi, e il materiale è stato analizzato mediante Western blotting. Questo test può essere facilmente adattato per studiare altre interazioni proteine sensibili al detersivo.

Lisati sono stati preparati da 3T3 L1 cellule transfettate stabile con sortilina-myc/His5 e da cellule WT 3T3 L1, usate come controllo negativo. Entrambi lisati sono stati incubati con perle di cobalto a pH 6 o pH 8 e lavate accuratamente. Perline con proteine immobilizzate sono state incubate nella soluzione di Myc-fll-Glut4. Dopo attenti lavaggi, proteine legate ai talloni sono stati eluiti con 0,25 M imidazolo. Campioni sono stati sottoposti, insieme con i lisat...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana utilizzando l'associazione del ricevitore dell'ordinamento, sortilina, per il primo ciclo di luminal della proteina del trasportatore del glucosio, GLUT4, ad esempio.

Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Misurazione delle interazioni tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni delle piante mediante sFLIM in base all'autofluorescenza nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analisi per la Determinazione Quantitativa della Palmitoylation delle Proteine della Membrana Cerebrale

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione