Name: detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00
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이 작품은 DK52057 및 K.V.K. X.P에 NIH에서 DK107498는 NIH에서 제도적 교육 부여 2T32DK007201에 의해 지원 되었다 연구 보조금에 의해 지원 되었다.

1. 펩 티 드의 처리
<ol><li>디자인 및 펩 티 드 순서<ol>
<li>펩 티 드, 원하는 시퀀스 선택한 myc 피토 프 (EQKLISEED)에서 그 중 N-또는 C-말단 같은 태그를 추가 합니다.</li>
		<li>펩 티 드 가용성 계산기 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php를 사용 하 여 물에 펩 티 드의 예측된 가용성을 확인 합니다. 용 해도 낮은 경우 충전 균형을 변경 하려면 다른 수용 성 태그를 추가 하십시오. 참고: 우리는 N 종?...

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

Sortilin는 진화 보존된 멀티 ligand 단백질 수용 체 세포내 정렬 이벤트6,7와 원형질 막에 두 신호에 관련 된 이다. 그러나, 정통 sortilin의 ligands (일부는 luminal 또는 완전 한 막 단백질)에 대 한 검색은 복잡 하다 바인딩 파트너의 일부와 함께 sortilin의 상호 작용 세제에 민감한 것 같다. 따라서, 쉽게 그리고 단백질 단백질 상호 작용, 공부에 대 한 광범위 한 ?...

GLUT4 지방과 골격 근육 세포 그것 후 높은가격순 혈액 포도 당 정리1에 인슐린의 효과 중재 하는 곳에 주로 표현 되는 포도 당 운송업 자 단백질 이다. 매우 안정적인 단백질 이기 때문에, GLUT4 닢 수준에 통제 된다. 인슐린의 부재에 GLUT4 크게 원형질 막 (포도 당에 대 한 따라서 낮은 기저 침투성)에서 제외 되 고 주로 셀 내부를 작은 인슐린 응답 소포 (IRVs)에서 지역화 및 trans Golgi 네트워크 (TGN) 나타낼 수 있는 어브 기증자 구획입니다. 인슐린 관리 시는 IRVs 원형질 막으로 융합 하 고 그 작동의 사이트에 GLUT4를 제공 합니다. 그래서 adipocytes 및 골격 myocytes 혈액에서 포도 당 통풍 관 그 상승 10 ~ 40이 혈당, 원형질 막의 침투성을 증가 합니다. 인슐린 철수 후 GLUT4 초기/정렬 endosomes에 내 고 검색 TGN는 IRVs는 다시 형성 하. 두 정렬 단계 GLUT4 통로, 즉 주변 초기 endosomes에서 perinuclear TGN을 검색에는 IRVs의 대형 막 Vps10p 가족, 형식을 나타내는 sortilin에 의해 활성화 되어 TGN 기증자에 나 막 횡단 단백질 그리고 정렬 수용 체입니다. Sortilin 비 계 막 횡단 단백질으로 작동 하는 하나의 모델에 따르면: 그것은 GLUT4 endosomes의 TGN, 루멘에 바인딩하고 신병은 기증자 막 통해 의 세포질 측에 retromer 또는 clathrin 어댑터의 C-터미널2, 3. 세포내 구획 사이 GLUT4 이동 기공을 사업자에 GLUT4의 배포를 용이 하 게이.
Retromer와 다양 한 접합 기 단백질 sortilin의 세포질 꼬리의 상호 작용을 잘 문서화 되었습니다. 그러나, sortilin GLUT4 (와 몇몇의 다른 단백질 ligands)의 바인딩 증명 하기 위해 도전 하고있다. 특히, 공동 immunoprecipitate sortilin 및 GLUT4 하려고가 두 단백질 사이 상호 작용의 세제에 민감한 특성상 아마 성공 되지 않았습니다. 또한 일반 운송업 자 단백질 GLUT4 12 막 횡단 도메인 및 6 luminal 루프는 조합 잠재적으로 sortilin 바인딩 사이트를 나타낼 수 있다. 동시에 효 모 2 잡종 시스템에 막 침투성 DSP와 상호 작용 cross-linking 셀에 실질적인 공동 지역화 등 간접 증거의 큰 몸 그 sortilin GLUT4 바인딩할 수 있는 것이 좋습니다. 또한, mutagenesis 스캔 알라닌과 조합에서 후자의 방식을 사용 하 여 우리는 이전 결정 sortilin의 Vps10p 도메인 주로 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 바인딩합니다. 그러나, 포유류 세포에 이러한 상호 작용의 증거는 실종 되었습니다. 여기, 우리 산 성 환경에서 유사한 transfected 3T3-L1 셀 코발트 수 지를 사용 하 여 pH 6 및 pH 8에 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 해당 하는 화학적으로 합성된 펩 티 드와 상호 작용할 수 있는 증명에서 그의 태그 sortilin 격리는 endosomal 루멘 그리고 TGN 막의 루멘에서 중립 환경. 아니 펩 티 드 바인딩 비 transfected 세포에서 준비 된 추출 물 같은 구슬에 로드 된 컨트롤 실험에서 발견 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td style="width:167px;">for use in purification of histidine tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mL Insulin Syringe U-100</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329652</td>
			<td style="width:167px;">26G x 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:107px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">23228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-234</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HisPur Cobalt Resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">89964</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tricine sample Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0739</td>
			<td style="width:167px;">with SDS, bMercaptaethanol should be added</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Elution&#160; Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-236</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-3115</td>
			<td style="width:167px;">For seperation of peptide and small protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris/Tricine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transfer Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-190</td>
			<td style="width:167px;">Add 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrocellulose membrane&#160; 0.45 mm</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;">BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti Myc antibody</td>
			<td style="width:107px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2272</td>
			<td style="width:167px;">Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide</td>
			<td style="width:107px;">Genscipt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>customize ordering</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precision Plus Protein Dual color Standarts</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

단백질 단백질 상호 작용을 탐구 하는 능력은 셀에 규제 연결을 이해 하는 열쇠. 그러나, 많은 경우에 단백질-단백질 상호 작용의 중요 한 실험 과제와 연결 됩니다. 특히, 정렬 수용 체 그들의 단백질 화물이이 단백질의 공동-immunoprecipitation을 사용할 수 없게 만드는 세제에 민감한 패션에서 자주 막 구획의 루멘에서 상호 작용 합니다. 포도 당 운송업 자 GLUT4 약한 luminal 상호 막 단백질의 한 예로 봉사 수로 정렬 수용 체 sortilin의 바인딩. 여기, 우리는 sortilin 및 GLUT4 사이의 상호 작용을 확인 하기 위해, 간단한, 빠르고 저렴 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 설계 및 GLUT4 luminal 부분에 잠재적인 sortilin 바인딩 epitope를 해당 myc 태그 펩타이드를 화학적으로 합성. Sortilin 6 히스티딘 태그로 포유류 세포에 표현 되었고 세포 lysates 코발트 비즈를 사용 하 여에서 격리. Sortilin 구슬에 움직일 수 다른 pH 값, 펩 티 드 솔루션으로 알을 품는 그리고 서쪽 blotting에 의해 eluted 자료 분석. 이 분석 결과 다른 세제에 민감한 단백질-단백질 상호 작용 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다.

Lysates L1 셀 Sortilin-myc를 / 그의5 와 WT 3T3 L1 셀, 부정적인 컨트롤 사용에서 안정적으로 페 3T3에서 준비 되었다. 두 lysates pH 6 또는 pH 8에 코발트 구슬과 incubated 되었고 철저 하 게 씻어. 고정 단백질 구슬 Myc fll Glut4 솔루션에서 incubated 다음 했다. 주의 세척 후 단백질 구슬에 바인딩된 했다 eluted 0.25 M 이미와 함께. SDS-페이지 10-20% Tricine sortilin-myc를 / 그의 둘 다...

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Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

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네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

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