Name: detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00
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Este trabalho foi financiado pelo DK52057 e DK107498 do NIH para X.P de K.V.K foi apoiada pelo 2T32DK007201 de concessão a formação institucional do NIH de bolsas de investigação.

1. manipulação do Peptide
<ol><li>Design e ordenação do peptide<ol>
<li>Escolha a sequência desejada do peptide e adicionar uma marca, como myc epítopo (EQKLISEED) no seu ou N - ou C-terminal.</li>
		<li>Verifica a solubilidade prevista do peptide em água, usando peptídeo solubilidade calculadora http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se a solubilidade é baixa, tente adicionar outra tag solúvel em água, para alterar o equilíbrio de carga. Nota: Usamos o peptídeo correspondente ao primeiro...

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

Sortilin é um receptor de proteína de ligante multi conservada evolucionária que está envolvido em ambos sinalização na membrana plasmática e no intracelular classificação eventos6,7. No entanto, a busca por ligantes do sortilin o autêntico (alguns dos quais são proteínas de membrana luminal ou integral) é complicada, como a interação do sortilin com alguns dos seus parceiros de ligação parece ser sensível aos detergentes. Portanto, uma fácil e...

GLUT4 é uma proteína de transporte de glicose que se expressa predominantemente nas células do músculo esquelético e gordura onde que medeia o efeito da insulina no sangue pós-prandial glicose autorização1. Sendo uma proteína muito estável, GLUT4 é regulada em um nível pós-traducional. Na ausência de insulina, GLUT4 é em grande parte excluídos da membrana plasmática (daí baixa permeabilidade basal de glicose) e está localizado principalmente no interior da célula em pequenas vesículas insulin-responsivos (IRVs) e rede trans-Golgi (TGN) que é provável que representam o compartimento do doador IRV. Após a administração de insulina, os IRVs se fundem com a membrana plasmática e entregam GLUT4 para o site do seu funcionamento. Isto aumenta a permeabilidade da membrana plasmática de glicose, assim a absorção de glicose do sangue em adipócitos e miócitos esqueléticos aumenta 10 a 40 vezes. Após a retirada da insulina, GLUT4 é interiorizado em endossomos iniciais/classificação e então obtida para TGN onde os IRVs são re-formados. Ambos classificação passos na via de GLUT4, ou seja, recuperação dos periféricos endossomos iniciais para o perinuclear TGN e a formação dos IRVs sobre o doador TGN membranas são ativadas pelo membro da família Vps10p, sortilin, que representa um tipo I proteína transmembranar e um receptor de classificação. De acordo com um modelo, o sortilin funciona como uma proteína transmembrana andaime: liga GLUT4 no lúmen dos endossomos e TGN e recrutas retromer ou Clatrina adaptadores para o lado citoplasmático da doadora membrana através de seu C-terminal2, 3. isso facilita a distribuição de GLUT4 em operadoras vesiculares que translocar GLUT4 entre compartimentos intracelulares.
A interação da cauda citoplasmática de sortilin com retromer e várias proteínas do adaptador tem sido bem documentada. No entanto, a ligação do sortilin GLUT4 (e vários de seus outros ligantes de proteína) tem sido desafiador para provar. Em particular, as tentativas de co-immunoprecipitate sortilin e GLUT4 não foram bem sucedidas, provavelmente devido à natureza de detergente sensível da interação entre estas duas proteínas. Além disso, como uma proteína de transporte típico, GLUT4 tem 12 domínios transmembranares e 6 loops luminal qualquer combinação de que potencialmente pode representar um sítio de ligação a sortilin. Ao mesmo tempo, um grande corpo de evidências indiretas, tais como localização co substancial na célula, cross-linking com DSP membrana permeável e a interação em dois sistema híbrido de levedura sugerem que sortilin pode ligar a GLUT4. Além disso, usando a última abordagem em uma combinação com a alanina digitalização mutagênese, nós determinamos anteriormente que o domínio de Vps10p de sortilin vincula-se principalmente para o primeiro loop luminal de GLUT4. No entanto, a prova de tal interação em células de mamíferos está desaparecido. Aqui, isolamos o sortilin com sua Tag de células transfectadas 3T3-L1 usando resina de cobalto e demonstrado que ele pode interagir com quimicamente sintetizado peptídeo correspondente ao primeiro loop luminal de GLUT4 no pH 6 e pH 8 que se assemelham a meio ácido na CDDP lúmen e ambiente neutro no lúmen das membranas TGN. Nenhuma ligação de peptídeo foi detectada em experimentos de controle onde o extrato preparado a partir de células transfectadas não foi carregado sobre as mesmas contas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td style="width:167px;">for use in purification of histidine tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mL Insulin Syringe U-100</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329652</td>
			<td style="width:167px;">26G x 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:107px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">23228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-234</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HisPur Cobalt Resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">89964</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tricine sample Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0739</td>
			<td style="width:167px;">with SDS, bMercaptaethanol should be added</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Elution&#160; Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-236</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-3115</td>
			<td style="width:167px;">For seperation of peptide and small protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris/Tricine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transfer Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-190</td>
			<td style="width:167px;">Add 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrocellulose membrane&#160; 0.45 mm</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;">BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti Myc antibody</td>
			<td style="width:107px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2272</td>
			<td style="width:167px;">Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide</td>
			<td style="width:107px;">Genscipt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>customize ordering</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precision Plus Protein Dual color Standarts</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

Nossa capacidade de explorar as interações da proteína-proteína é a chave para a compreensão de conexões regulamentares na célula. No entanto, a detecção de interações da proteína-proteína em muitos casos é associada com desafios significativos experimentais. Em particular, classificação de receptores interagem com sua carga de proteína no lúmen dos compartimentos da membrana muitas vezes de forma sensível detergente, fazendo co-imunoprecipitação destas proteínas inutilizável. Ligação da classificação sortilin do receptor para o transportador de glicose que GLUT4 pode servir como um exemplo de fracos luminal interações entre proteínas de membrana. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, simples e barato para validar a interação entre sortilin e GLUT4. Por isso, nós temos projetado e quimicamente sintetizado o peptídeo myc-tag correspondente para o potencial sortilin-ligação epítopo na parte luminal de GLUT4. Sortilin marcado com seis histidines foi expressa em células de mamíferos e isolada de lisados celulares usando grânulos de cobalto. Sortilin imobilizada em grânulos foi incubado com a solução de peptídeo em valores de pH diferentes, e o material eluted foi analisada pela mancha ocidental. Este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outras interações da proteína-proteína de detergente sensíveis.

Lisados foram preparados a partir 3T3 L1 células transfectadas estàvel com Sortilin-myc/His5 e de células de L1 3T3 WT, usadas como um controle negativo. Ambos os lisados foram incubados com grânulos de cobalto em pH 6 ou pH 8 e cuidadosamente lavados. Grânulos com proteínas imobilizadas em seguida foram incubados na solução de Myc-fll-Glut4. Após cuidadosos lavagens, proteínas vinculadas aos talões foram eluídas com 0,25 M de imidazol. Amostras foram s...

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Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Descreveremos um protocolo para a deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana, usando a ligação do receptor classificação, sortilin, o primeiro loop luminal da proteína do transportador de glicose, GLUT4, como exemplo.

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Bioquímica

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Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

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Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

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