Name: detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Detta arbete stöds av forskningsanslag som DK52057 och DK107498 från NIH till K.V.K. X.P stöddes av den institutionella utbildningen grant 2T32DK007201 från NIH.

1. hantering av peptiden
<ol><li>Design och beställning av peptiden<ol>
<li>Välj den önska sekvensen av peptiden och lägga till en etikett, t ex myc epitop (EQKLISEED) på dess antingen N - eller C-terminus.</li>
		<li>Kontrollera den förutspådda lösligheten av peptiden i vatten med peptid löslighet kalkylator http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Om lösligheten är låg, försök lägga till en annan vattenlösliga tagg om du vill ändra kostnad balansen. Obs: Vi använde peptiden motsvarar...

<ol>
	<li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes.">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li><li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+is+sIRVed:+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers.">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li><li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li><li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4.">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li><li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes.">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li><li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shortcut+to+the+lysosome:+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway.">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95/sortilin,+a+non-G-protein-coupled+receptor.">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li><li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor.">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li><li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain.">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li><li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death.">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li></ol>

Sortilin är en evolutionärt bevarade flera ligand protein receptor som är inblandad i båda signalering vid plasmamembranet och intracellulär sortering händelser6,7. Sökandet efter den autentiska sortilin ligander (varav vissa är luminala eller integrerad membranproteiner) är dock komplicerade samspelet mellan sortilin och några av dess bindande partner verkar vara känsliga för rengöringsmedel. Därför, en lätt och en omfattande strategi för att st...

GLUT4 är en glukos transporter protein som uttrycks huvudsakligen i fett-och skelettmuskler celler där det medierar effekten av insulin på postprandiellt blod glukos clearance1. Att vara en mycket stabil protein, är GLUT4 reglerat på posttranslationella nivå. I avsaknad av insulin, GLUT4 är i stort sett uteslutet från plasmamembranet (därav låg basal permeabilitet för glukos) och är lokaliserad främst inne i cellen i små insulin-lyhörd blåsor (IRVs) och trans-Golgi nätverk (TGN) som sannolikt kommer att representera IRV givare facket. Vid administrering av insulin, IRVs säkring med plasmamembranet och leverera GLUT4 till platsen för dess funktion. Detta ökar permeabiliteten i plasmamembranet för glukos, så att glukosupptag från blodet in i adipocyter och skelett myocyter stiger 10 till 40-fold. Efter insulin tillbakadragande, är GLUT4 internaliseras i tidig/sortering endosomes och sedan Hämtad till TGN där IRVs är åter bildade. Båda sortering steg i GLUT4 vägen, d.v.s. hämtning från de perifera tidig endosomes till perinukleära TGN och bildandet av IRVs om TGN givaren membran är aktiverade som den Vps10p familjemedlemmen, sortilin, som representerar en typ jag transmembrane protein och en sortering receptor. Enligt en modell, sortilin fungerar som en transmembrana byggnadsställning protein: den binder GLUT4 i lumen av endosomes och TGN och rekryterar retromer eller clathrin adaptrar till cytoplasmiska sida av den givare membran via dess C-terminus2, 3. Detta underlättar fördelningen av GLUT4 i vesikulär bärare som translocate GLUT4 mellan intracellulär fack.
Samspelet mellan den cytoplasmiska svansen av sortilin med retromer och olika adapter proteiner är väl dokumenterat. Bindningen av sortilin GLUT4 (och flera av dess andra protein ligander) har dock varit en utmaning för att bevisa. Försök att co-immunoprecipitate sortilin och GLUT4 har särskilt inte lyckats förmodligen på grund av hur tvättmedel-känsliga samspelet mellan dessa två proteiner. Som en typisk transportör protein, har GLUT4 dessutom 12 transmembrana domänerna och 6 luminala slingor någon kombination som potentiellt kan representera en sortilin-bindningsstället. På samma gång, en stor mängd indirekta bevis, såsom betydande Co lokalisering i cellen, cross-linking med membran-permeable DSP, och samspelet i jäst två hybridsystem föreslår att sortilin kan binda till GLUT4. Dessutom har använder den senare metoden i kombination med den alanin skanning mutagenes, vi tidigare konstaterat att domänen Vps10p av sortilin binder primärt till den första luminala öglan av GLUT4. Bevis på sådan interaktion i däggdjursceller har dock saknas. Här, vi har isolerat hans-taggade sortilin från transfekterade 3T3-L1 celler använder kobolt harts och visat att det kan interagera med kemiskt syntetiserade peptid motsvarar den första luminala öglan av GLUT4 vid pH 6 och pH 8 som liknar sur miljö i den endosomal lumen och neutral miljö i lumen av TGN membran. Ingen peptid bindning identifierades i kontroll experiment där extrakt som framställts av icke-transfekterade celler lästes på samma pärlor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td style="width:167px;">for use in purification of histidine tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mL Insulin Syringe U-100</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329652</td>
			<td style="width:167px;">26G x 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:107px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">23228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-234</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HisPur Cobalt Resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">89964</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tricine sample Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0739</td>
			<td style="width:167px;">with SDS, bMercaptaethanol should be added</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Elution&#160; Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-236</td>
			<td style="width:167px;">For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-3115</td>
			<td style="width:167px;">For seperation of peptide and small protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris/Tricine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transfer Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-190</td>
			<td style="width:167px;">Add 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrocellulose membrane&#160; 0.45 mm</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;">BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti Myc antibody</td>
			<td style="width:107px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2272</td>
			<td style="width:167px;">Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptide</td>
			<td style="width:107px;">Genscipt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>customize ordering</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precision Plus Protein Dual color Standarts</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins

Vår förmåga att utforska protein-protein interaktioner är nyckeln till att förstå regulatoriska anslutningar i cellen. Påvisande av protein-protein interaktioner i många fall är dock associerade med betydande experimentella utmaningar. I synnerhet interagerar sortering receptorer med deras protein Last i lumen av membran facken ofta i ett tvättmedel-känsliga sätt, göra co-immunoprecipitation av dessa proteiner oanvändbar. Bindande för den sortering receptor sortilin till glukostransportör GLUT4 kan tjäna som ett exempel på svag luminala interaktioner mellan membranproteiner. Här beskriver vi en snabb, enkel och billig analys för att validera samspelet mellan sortilin och GLUT4. För att har vi utformat och kemiskt syntetiserade myc-taggade peptiden motsvarar den potentiella sortilin-bindande epitop i luminala delen av GLUT4. Sortilin taggade med sex histidines var uttryckt i däggdjursceller och isolerad från cell lysates använder kobolt pärlor. Sortilin orörlig på pärlor var inkuberas med lösningen peptid vid olika pH-värden, och eluerat materialet analyserades av Western blotting. Denna analys kan lätt anpassas till studera andra tvättmedel-känsliga protein-protein interaktioner.

Lysates utarbetades från 3T3 L1 celler stabilt transfekterade med Sortilin-myc/hans5 och från WT 3T3 L1 celler, som används som en negativ kontroll. Båda lysates var inkuberas med kobolt pärlor på pH 6 eller pH 8 och noggrant tvättas. Pärlor med immobiliserade proteiner inkuberades sedan i lösningen av Myc-fll-Glut4. Efter noggrann tvättar, var proteinerna bunden till pärlorna elueras med 0,25 M Imidazol. Proverna utsattes, tillsammans med den ursprungli...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins at JoVE.com

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Vi beskriver ett protokoll för detektion av tvättmedel-känsliga samspelet mellan membranproteiner med bindande av sortering receptor, sortilin, till den första luminala loopen av glukos transporter protein, GLUT4, som exempel.

Påvisande av tvättmedel-känsliga samspelet mellan membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mätning av interaktioner mellan fluorescerande sonder och lignin i Plant sektioner av sFLIM baserat på ursprunglig Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analys för kvantitativ bestämning av palmitolerisering av hjärnans membranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Mätning av nukleotidbindning till intakta, funktionella membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd