Name: collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species at JoVE.

המחברים רוצה להודות פוסי ג'יימס על עבודתו מעולה על כל צילום וידאו ועיבוד וידאו; מייקל מרטי עבור עבודתו מעולה דור של בקר דיגיטלי תמונות; ליליה וולתר עזרה עם החילוץ-RNA ו- Bioanalyzer פועל; מיטש פאלמר, קארלי Kanipe סקירה מועילה, משוב על הצומת לימפה תמונות; טיפול בבעלי חיים ואת צוות וטרינרי המרכז הלאומי למחלות בעלי חיים על כל העבודה הקשה שלהם, סיוע עם גידול בעלי חיים והכנה necropsies.

ההליכים necropsy בעלי חיים המתואר כאן מכוסים במסגרת הפרוטוקולים המאושרים IACUC במרכז הלאומי חיה המחלה, איימס, חקירות פנים כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות מאושרים עבור טיפול בבעלי חיים ורווחה.
1. קדם תכנון לפני Necropsy
<ol><li>לפני necropsy, להכין את החומרים הבאים עבור הובלה לסוויטה necropsy:<ol>
...

הרוב המכריע של מחקרים transcriptomic והפרוטוקולים המשויכים מתמקדים עכבר, חולדה או פוסט-מורטם דגימות אנושי. עם זאת, חקירות חיות המשק וחיות מספקים מגוון רחב של הזדמנויות עבור האפיון של התגובה החיסונית מחלה, הן לפי הצורך רפואה וטרינרית ו, לגבי מחלות שפוגעות, לבריאות הציבור האדם. פרוטוקול זה סיפק מית...

ניתוח ה-RNA-רצף של transcriptome של בלוטות הלימפה מספק את ההזדמנות כדי לאפיין את התגובה החיסונית של חיות למגוון של פתוגנים. אמנם יש כבר מנוצל מתודולוגיה זו בהרחבה בעכברים, ניתוח הרחבת לאחרונה לתוך יונקים גדולים1,2. משק חי/גדולים בעלי חיים בלוטות הלימפה יכול לשמש כדי לאפיין תגובות המארח, זיהום, לא רק לשימוש שלהם חיסון או רגישות גנטית מחקרים, לצורך זיהוי מטרות עבור פיתוח התרופה, אלא גם דגם מערכות עבור מחקרים בבני אדם על מחלות שפוגעות. לדוגמה, במקרה של ברוצלוזיס (מחלה חיידקית שפוגעות כי ההשפעות חצי מיליון אנשים ברחבי העולם בכל שנה), למרות גדל באופן משמעותי בעלויות, לימודי כבשים או עיזים שהן יותר רלוונטיות הדבקת בני אדם, החיסון האנושית פיתוח מודלים חיות מעבדה. העכבר זיהום מודלים מסכם את הדברים הזיהום מערכת reticuloendothelial אבל לא את הסימנים הקליניים האופייניים3.
בניסויים בבעלי חיים גדולים לעומת מעבדה מחקרים שנעשו בבעלי חיים, התהליך של רקמות קציר בהכרח כרוך עיכוב ארוך יותר בין המתת החסד ואת האוסף רקמות, אשר מהווה אתגר פוטנציאל לשימור RNA באיכות גבוהה. RNA תקין חיוני לדור של נתונים transcriptomic רלוונטי מבחינה ביולוגית. הדור של RNA באיכות גבוהה של דגימות רקמה קריטי במיוחד ללימודי הפתוגן בעלי חיים גדולים מתבצע תוך מתקני כליאה. מחקרים כאלה הם מטבעם יותר קשה לבצע כפי שהם דורשים אישרה מתקנים, מאומנים כוח אדם אלא גם לשאת משמעותי בעלות הכספית, אשר, בהתאם לעבודה, יכול לנוע בין עשרות למאות אלפי דולרים. סוגי מחקרים אלה כרוכים גם שיתוף פעולה בין-תחומית והידע רב-תחומי להשלמת שלהם, הוספת את המורכבות שלהם. לכן, הדרכה, התפתחות, ואת הדבקות מערכת יעילה של המדגם אוסף שימור מספק יתרונות משמעותיים במחקרים מולקולריים במורד הזרם של רקמות של חיות נגועות.
האוסף של בלוטות הלימפה גדול מציג אתגרים נוספים עבור אוסף רקמה לעומת דגימה דומה מאתר בלוטות הלימפה. ההכנה הכריתה מדגם מחייבת הבנה בסיסית של האנטומיה של הצומת לימפה, לרבות המבנים הפנימיים הרלוונטיים. המבנה של הלימפה מורכבת של האוניות הלימפה מוקף הסינוסים מלא הלימפה. מבנים אלה מוקפים בתוך כמוסה קשה, סיביים. 4 lobule הלימפה "אנטומי פונקציונלי היחידה הבסיסית של הצומת לימפה", מורכב זקיקי, יחידת עמוק בקליפת המוח, ואת מיתרי מדולרי הסינוסים4 (איור 1 א'). B ו- T לימפוציטים הם ביתו זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח, בהתאמה. מבנים אלה מספקים לפיגום תלת-ממד, להקל על האינטראקציה בין לימפוציטים וגם אנטיגן או אנטיגן הצגת תאים.
רווחתה, זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח ניתן לזהות במשטח לחתוך כפי שהם מכילים meshwork רשתי צפופה מופיעים יותר הסינוסים, המורכב מעובדים meshwork רשתי עדין יותר ואשר נראה בהיר יותר כהה (איור 1B). לפי המוסכמות, פתולוגים להפנות האזורים של בלוטות הלימפה כמו קליפת שטחית (זקיקים), את paracortex (יחידות עמוק בקליפת המוח) לשד (מיתרי מדולרי, הסינוסים). בדיקה נכונה של כל שלושה אזורים שסברו הטובה ביותר תרגול בהנחיות שגרתית פתולוגיים הלימפה5. שימו לב כי יש וריאציה ניכר עקביות, גודל וצבע של בלוטות הלימפה, אפילו בתוך חיים בודד. כמו בעלי חיים גיל, בלוטות הלימפה שלהם נוטים להקטין את גודל להיות מוצק יותר מאלה של חיים צעירים, בדרך כלל עקב גידול רקמות החיבור שלהם וירידה רגיל הלימפה מבנה6,7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> איור 1. אנטומיה של הצומת לימפה. (א) תמונה קריקטורה זו מראה את האנטומיה של הצומת לימפה, המתארים מבנים מרכזיים. (B) תמונה זו עדיין מציגה לימפה שור חותכים חתך הרוחב. המבנים/השכבות הרלוונטיות הגלויים לעין מודגשים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בהתאם השאלה ניסיוני, הלימפה שונים יהיה עניין עבור איסוף וניתוח. בלוטות הלימפה ההיקפית הם אלה נמצא עמוק בתוך הרקמה התת עורית. הבקר, בלוטות הלימפה היקפי או שטחי משמש לעתים קרובות באימון קליניים וניסויים לכלול הפרוטיד, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural), שטחי במפשעה (supramammary אצל נקבות, האשכים אצל זכרים) ( איור 2). טבלה 1, מאפייני מפתח בלוטות הלימפה שטחית, כמתואר ב- במערכת ' בקר '8, מתוארים. להלן, כמה תוכניות אוסף הצומת לימפה פוטנציאל למחלות זיהומיות חיידקים של הבקר מוצגים כנקודת התחלה עבור החקירה.
Melitensis abortus/Brucella brucella: תקן necropsies עבור abortus דרב-נגוע בקר ו melitensis דרב-עזים נגוע במרכז הלאומי חיה המחלה לשחזר supramammary, prescapular, רקמות parotid בלוטת לימפה , הן של שיוף שהספירה חיידקי ועל ההכנה RNA פרופיל ביטוי מארח ה-RNA. Abortus דרב ניתן לשחזר באופן קבוע בכל אחד מאותם בלוטות הלימפה בקר נגוע השפעול9. הנוכחות של חיידקים בכל אחד מסוגי הלימפה ניתן להבחין ב- melitensisבנגוע עזים עד לפחות תשעה חודשים לאחר הפגיעה באמצעות למתודולוגיות מבוססי ה-RNA ממחקרים שלנו (Boggiatto. et al., לא פורסם). סלמונלה sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), ואת בלוטות לימפה mesenteric היו שימושיים במהלך יצירת פרופילים של פגרי הבקר סלמונלה השכיחות10,11,12 , יהיה עניין פוטנציאלי ללימודי transcriptomic. E. coli O157:H7: בלוטות לימפה mesenteric (-המעי הדק האמצעית והמיקומים המעי הדק הדיסטלי) יכול להיות האתרים של שחזור של פה ושם של חיידקים עגלים הנגוע (אך לא נגוע הבקר מבוגרים)13. לפטוספירוזיס (Leptospira sp.): התמדה כרונית של החיידקים נצפתה בקשרי הלימפה ניקוז בלוטת חלב14. Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס : בבקר, החיידק כבר התאושש זיהום שלאחר ניסיוני של בלוטות הלימפה mediastinal, tracheobronchial של עגלים15. בנוסף, הצומת לימפה RNA יש כבר מנוצל כדי לבחון תגובות לארח בעלי חיים גדולים וירוסים, כגון וירוס חזירי תסמונת הרבייה, מערכת הנשימה2. איור 2 מציג את המיקום של קבוצת משנה של אלה הלימפה העיקרי בגוף הבקר.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> איור 2: קריקטורה המתארים במיקומים שנבחרו הלימפה בבית השחי הצומת פרות, המטופחות . בלוטות הלימפה ממוספרת הם מבואר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
נייר זה ווידאו משויך, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של גדול הלימפה חיה ללימודים RNA, תוכנן להיות אינפורמטיבי עבור פיצחו המעורבים במחקרים transcriptomic של זיהומים בעלי חיים גדולים. ראשית, אנו מספקים סקירה של ההליך בידוד בלוטות הלימפה, באמצעות דגימת רקמות שור, ביזון כדוגמאות. מזווג עם ההדגמה, כפי שהוא מוצג בסרט, הוא זרימת עבודה עבור דגימה רקמה לשחזור לבידוד RNA. בשלב הבא, אנו מתארים שיקולים חשובים עיבוד של הצומת לימפה נגועות, עם דגש על בטיחות, עקביות ואיכות RNA.
הכנת RNA מתוך הרקמה עם ריאגנט isothiocyanate פנול acidified-guanidine מבוסס על השיטה המקורית של Chomczynski וסאקי16,17, בטהרה על-מבוססות-סיליקה ספין עמודות רכוש סוכני chaotropic בהתבסס על העבודה המקורית של Vogelstein ו גילספי18. אנו בוחנים גם את הפוטנציאל ההתאוששות של RNA עבור transcriptomics מן הבקר הלימפה שנשמרו על-ידי שיטות אלטרנטיביות. לבסוף, אנו חוקרים את ההשפעה של המשתנה פעם על איכות ה-RNA ב necropsies בעלי חיים גדולים, כולל ניסוי נציג המתארים את ההשפעה של עלייה זמן בין המתת החסד הדגימה על הפרופיל RNA התאושש מן ביזון, . בלוטות לימפה שור מאמר זה יהיה מועיל לא רק פיצחו אלא גם ל וטרינרי חוקרים מתחיל transcriptomic מחקרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1239px;" width="1240">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM7020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:167px;">Daigger Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps, rat tooth</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-460-117</td>
			<td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mm punch biopsy needles</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9949469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharps container (small and transportable for necropsy)</td>
			<td style="width:167px;">Stericycle</td>
			<td style="width:119px;">8900SA</td>
			<td>1 qt. size shown here</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutting boards or disposable trays</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-002-24A</td>
			<td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal protective equipment</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12183018A</td>
			<td>Designed for up to 100 mg tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (General, for gel electrophoresis)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">1X TBE</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP24301</td>
			<td>Can also make from scratch in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S4117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">114391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Xylene cyanol&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:787px;">FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Plastic spreader (L-shaped spreader)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-665-231</td>
			<td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Necropsy knives</td>
			<td style="width:167px;">Livestock Concepts</td>
			<td style="width:119px;">WI-0009209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

חיות גדולות (הן חיות המשק וחיות) לשמש חשוב מאגרים של גורמי מחלה נגיפית, לרבות Brucella, חיידקי סטרפטקוקוס בוביס Mycobacterium, סלמונלהו- e. coli, והם שימושיים ללימוד פתוגנזה ו/או התפשטות החיידק ב hosts טבעי. כאשר פונקציית מפתח של בלוטות הלימפה בתגובה החיסונית המארח, רקמות לימפה לשמש מקור פוטנציאלי של RNA עבור ניתוחים transcriptomic במורד הזרם, כדי להעריך את השינויים הטמפורלי של ביטוי גנים בתאים במהלך זיהום. מאמר זה מציג סקירה של התהליך של הצומת לימפה אוסף דגימה רקמה, RNA במורד הזרם עיבוד במשק, באמצעות בקר (פרות, המטופחות) כמודל, עם דוגמאות נוספות מסופקים של ביזון אמריקאי (ביזון ביזון ). הפרוטוקול כולל מידע אודות מיקום, זיהוי, הסרה של בלוטות הלימפה מאתרים מרכזיים מרובים בגוף. בנוסף, מתודולוגיה דגימה ביופסיה מוצג המאפשר עקביות הדיגום מעבר בעלי חיים מרובים. מספר שיקולים לשימור הדגימה הנזכרים, כולל הדור של RNA מתאים מתודולוגיות במורד הזרם כמו רצפי RNA ו- RT-PCR. בשל עיכובים ממושכים הטמונה גדולים בעלי חיים לעומת העכבר פעם קורס לימודי, מוצגים תוצאות נציג ביזון ורקמות הלימפה שור כדי לתאר את מהלך הזמן השפלה בסוג זה רקמות, בהקשר של סקירה של עבודה מתודולוגי קודמות ב- RNA השפלה ברקמות אחרות. בסך הכל, פרוטוקול זה יהיה מועיל שני חוקרים וטרינרי מתחיל transcriptome פרויקטים על דגימות בעלי חיים גדולים, פיצחו המעוניינים ללמוד טכניקות ויוו רקמות דגימה ועיבוד במבחנה .

השימוש של השיקולים שהוצגו במאמר זה (שלבים 1-4 לפרוטוקול) יסייעו בשחזור של RNA מדגימות חיות גדולות מתאים ניתוח במורד הזרם במחקרים ביטוי גנים המארח. איכות ה-RNA ליישומים במורד הזרם מוערך על ידי אמצעים סטנדרטיים מרובים. עבור ספקטרופוטומטר, היחס280 A /A260מספק מדד לזיהום חלבון, היחס230...

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species at JoVE.

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

פרוטוקול זה מספק סקירה של נוהלי בידוד של RNA עבור פרופיל transcriptomic של הצומת לימפה רקמות חיות גדולות, כולל צעדים זיהוי, כריתה של בלוטות הלימפה של חיות המשק וחיות, דגימה גישות כדי לספק עקביות על-פני מספר בעלי חיים, שיקולים בתוספת תוצאות נציג פוסט אוסף שימור ועיבוד לניתוח RNA.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Hi, my name is Dr.Robert Schaut and I'm a scientist at the National Animal Disease Center in Ames, Iowa. In this JoVE video, we will be sharing with you information about the collection and processing of lymph nodes from large animals for use in downstream RNA experiments. For example, these experiments might include quantitative PCR on reverse transcribed products, or RNA sequencing studies of transcriptomes.Lymph nodes are useful samples for the assessment of host immune responses but can also provide a source of pathogen RNA for study, such as the case of intra-cellular pathogens present in immune cells inside lymph nodes. Samples from large animals, including both livestock and wildlife species, are of interest in the study of zoonotic diseases. Here, at the National Animal Disease Center, we study infections of livestock with species like brucella abortus, which causes brucellosis in cattle and bison, and E.Coli O157:H7 as shed from the intestinal tracks of cattle.We will also recover tissue samples from wildlife species, like deer and elk. A range of lymph nodes can be collected from animals infected with different diseases. Studies of tissues in these natural host species are generally more relevant to the natural progression of disease than mouse models.However the process of tissue harvesting from large species is necessarily more complicated than from mice, including the longer delay between euthanasia and tissue collection, and a larger size of lymph nodes. Here, we'll present a protocol for the isolation of large animal lymph nodes for RNA study that will be informative for molecular biologists involved in the transcriptomic studies of large animal infections, as well as veterinary researchers commencing transcriptomic studies. In this video, we will be demonstrating procedures on lymph nodes for cattle.Before necropsy, we recommend assembling the following supplies specific for tissue isolation procedure. Microfuge tubes filled with about 1ml of RNA tissue preservative, like RNAlater, disposable scalpels, clean and autoclave forceps, biopsy needles, a sharps container for used scalpels and needles, and either a cutting board or disposable tray, depending on the level of infectivity of the materials involved. In this case, we will demonstrate key elements of the procedure by using lymph nodes that we generally collect from cattle.They're infected with bacteria that cause brucellosis. These are the prescapular lymph nodes, and the parotid lymph node. When conducting a large animal necropsy for RNA recovery, it's useful to have at least three participants working on animal tissues.Dissector one will be in charge of large animal sectioning of different pieces of the animal, dissector two will recover lymph nodes from different animal sections at the main necropsy table, and dissector three will work at a separate table to isolate sections from each lymph node, and transfer them to tubes with preservative solution. We will start with the identification and removal of the prescapular lymph node. Ideally, palpation of a lymph node, prior to dissection, will help identify the location of the lymph node.While not always possible to detect, the prescapular lymph node is typically palpable in a healthy animal. Begin by placing the animal in lateral recumbency. Extend the shoulder by moving the front limb back at the level of the knee.This motion will bring the shoulder back, and allow for easy palpation of the lymph node. Feel for the presence of the lymph node as shown. Once located, and with the shoulder still extended, use a scalpel or necropsy knife to make a skin incision along the outline of the shoulder.Retract the skin to reveal the point of the shoulder and neck musculature. A section of subcutaneous fat is sometimes observed, especially in over-conditioned animals. The prescapular lymph node is often found with sections of subcutaneous fat.Here you can see the three layers of the skin, muscle, and subcutaneous fat. Once again, palpate the location of a lymph node. Unlike the subcutaneous fat, the lymph node will hold its shape when palpated.After locating the prescapular lymph node, carefully dissect out the subcutaneous fat, and dissect out the lymph node. The appearance of these lymph nodes in bison, which we used in brucellosis studies due to the susceptibility of bison in the Greater Yellowstone area to brucella, is similar. Here, we demonstrate the appearance of the prescapular lymph node, as dissected out of the right shoulder of an American bison.Next we will move to the isolation of the parotid lymph node. With the animal in lateral recumbency, locate the temporomandibular joint. Using a scalpel or necropsy knife, carefully make an incision on the skin.Start dorsal to the joint, and extend vertically along the jaw line. Dissect the skin away to reveal the subcutaneous tissue. The parotid salivary gland will be visible, first due to it's large size, lobulated surface appearance, and red coloration.Using forceps and scalpel, move the parotid salivary gland aside to find the parotid lymph node sitting just cranial and medial to the salivary gland. When isolating the parotid lymph node, it's critical to separate lymph node tissue from the tissue of the parotid salivary gland. The tissue types look distinct, including within the tissue cross-section.This can be observed here, with the parotid lymph node on the left, and the parotid salivary gland on the right. Be sure to carefully examine the parotid lymph node tissue for texture before further processing. In some cases, it may be necessary to excise the parotid salivary gland in order to locate the parotid lymph node.Here is an example of a parotid gland excised from a steer, in which the lymph node was embedded within the salivary gland and not visible before gland removal. Additional information about identification of selected lymph nodes is provided in the main manuscript. Once the lymph nodes have been collected, you're ready to excise sections for preservation.Use a scalpel or necropsy knife, remove a section of the lymph node, and make a sagittal cut to open up the lymph node. Examine the interior of the lymph node, especially in specimens from infected animals, looking for asymmetry, lesions, color differences, etc. In this bovine prescapular lymph node, multiple features are visible to the naked eye.These include follicles which are home to B lymphocytes, and deep cortical units, which are home to T cells. These reasons appear darker than the medullary sinuses, which are lighter. Here, another example of an uninfected lymph node is depicted.This lymph node is from a younger bison. Note the follicles are less distinct in this example. In order to section tissues for processing, one option is to collect small tissues pieces from each lymph node with a scalpel for subsequent RNA recovery.However one major challenge with comparing expression profiles between samples is the large size of large animal lymph nodes, as compared to a mouse lymph node which can be easily extracted whole for RNA extraction. As a result, small tissue sections will not evenly capture the profile of cells across a lymph node. Instead to capture cells across the profile of a lymph node, excise a pie-shaped wedge from the lymph node, cut into small pieces no thicker than 5mm, and placed, with forceps, into tubes containing RNAlater.Alternatively utilize biopsy methodologies to excise tissue sections from each lymph node. Select the punch biopsy tool if you would like to collect specific sections, such as specific follicles from the node, and then transfer, with forceps, to RNAlater. Once samples have been transferred to RNAlater, transfer them back to the lab and store at 4 degrees celsius overnight to allow for tissue penetration.Afterwards, poor off excess RNAlater and store tissue samples at 80 degrees celsius. A plus of using RNA preservative solution is that liquid nitrogen is not required at the necropsy, nor upon collection of samples from the field. Prior to accessing samples, pre-aliquot Trizol reagent to tubes for homogenization.After samples are removed from the freezer, transfer them immediately to Trizol reagent for subsequent processing, based on manufacturer's recommendations. Here, a piece of 50-100mg of tissue are transferred to Trizol reagent. Limit thawing prior to Trizol addition as much as possible.Storage on dry-ice can be used when multiple samples are removed from the freezer for processing. Place tubes on the homogenizer, and homogenize in Trizol reagent. Here, a two minute RNA extraction setting is used.When complete, check for a cloudy appearance. Repeat if necessary. Follow the manufacturer's protocol to generate aqueous and organic layers for each sample.Remove the upper clear aqueous phase with a pipette tip. Transfer to a new microcentrifuge tube. Next, mix with an equal volume of 100%ethanol.Mix thoroughly. The tube will often appear cloudy. With a micro-pipette tip, transfer the liquid to a silica-based commercial spin column to further purify and then elute your RNA.To assess RNA quality, load one or two l of the eluted RNA sample to a spectrophotometer for analysis. After completion of the procedure, we observe absorbance ratios of approximately two for the 260-280 ratio and the 260-230 ratio, indicating a high purity with minimal chemical carryover. Phenol contamination would be observable from a decrease in the 260-230nm absorbance ratio.During the necropsy procedure in the case of animals like bison, we observed a time period of at least 20 minutes between euthanasia and a transfer of the first tissue sample to preservative. In contrast, mouse lymph nodes can be removed and preserved after euthanasia in a matter of minutes. Therefore we were interested in characterizing the degradation profile of lymph nodes over time.In the main manuscript we also compiled a summary of RNA stability profiles in a range of other tissue types that have been tested in other publications. In representative experiments, conducted with bison lymph nodes, RNA stability was relatively consistent over the course of an hour after euthanasia. Here, we depict a gel image of total RNA purified from pieces of supramammary lymph node tissue from an American bison.This finding is consistent with previous data for other tissue types compiled from the literature. This suggests that samples of acceptable quality for downstream analysis of gene expression can be collected even from more challenging species like bison and elk. However it is important to appreciate that longer times between death and sample preservation can result in changes in RNA expression profiles, including increase in degradation from three prime end of mRNA transcripts.Therefore it is still important to utilize a rapid, streamlined workflow for tissue recovery in order to reduce further delay once the animal is available for necropsy, in order to achieve the most biologically valid RNA profiles. In addition, we note that care must be taken throughout the procedure to avoid introduction of RNA contaminants into the samples throughout the process, beyond those that are already present within the tissues. This includes the use of gloves as part of the other required personal protective equipment.We also aliquot the final RNA product into multiple tubes in order to limit freestalling of RNA samples as much as possible. For example, separate aliquots can be stored for use in quality control tests. In summary, in this video we have provided important information for the use in identification, collection, representative sampling, and processing of lymph nodes for downstream gene expression analysis.While our representative video has been demonstrated with cattle and bison examples, we have also worked with lymph nodes from other large species, including goats and elk. We hope you'll find this video useful in your work, whether you are a veterinary scientist considering the use of transcriptomic methods in your work, or a molecular biologist interested into venturing into the field of large animal science.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

צומת Murine שטחית לימפה ניתוח

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...