Name: a microbiomechanical system for studying varicosity formation and recovery in central neuron axons
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons at JoVE.com

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا "معاهد لصحة الحيوان استخدام المبادئ التوجيهية الوطنية". وأيد هذا العمل جزئيا المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01NS093073 و R21AA024873) لجيم قو.

جميع الأساليب المذكورة أدناه عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية أوهايو.
1-إعداد ساترة
<ol><li>ضع مربعات واحد أو أكثر من كوفيرسليبس 12 مم أو 25 مم داخل كوب زجاج الذي يحتوي على 70% وحمض النيتريك، واحتضان كوفيرسليبس في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضح...

<ol>
	<li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 17, 495-499 (2011).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+degeneration+after+injury+and+in+development+by+the+endogenous+calpain+inhibitor+calpastatin.">Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin.</a> Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).</li><li>Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+in+the+axon.">Information processing in the axon.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).</li><li>Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+varicosity+initiation+in+central+neuron+mechanosensation.">Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation.</a> J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).</li><li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+axonal+stretch+injury+in+vitro+induces+a+progressive+series+of+neurofilament+alterations+ultimately+leading+to+delayed+axotomy.">Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy.</a> J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).</li><li>Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin-A+treatment+attenuates+delayed+cytoskeletal+alterations+and+secondary+axotomy+following+mild+axonal+stretch+injury.">Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury.</a> Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+interruption+of+axonal+transport+due+to+microtubule+breakage+accounts+for+the+formation+of+periodic+varicosities+after+traumatic+axonal+injury.">Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury.</a> Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).</li><li>Donkin, J. J., Vink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cerebral+edema+in+traumatic+brain+injury:+therapeutic+developments.">Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments.</a> Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+stimulator+for+localized+cell+loading:+fabrication+and+strain+analysis.">Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis.</a> J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation.">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li><li>Franze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+branch+retraction+is+caused+by+a+threshold-dependent+mechanical+impact.">Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact.</a> Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).</li><li>Camp&#224;s, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li></ol>

يتم إجراء هذا الفحص ميكروبيوميتشانيكال على التوالي إلى الأمام. سوف ينتج نتائج يمكن الاعتماد عليها، إذا كانت جميع خطواتها تنفذ بعناية. وهناك العديد من الخطوات الرئيسية التي، إذا كان أداؤها غير سليمة، وسوف تعوق جمع البيانات الناجحة. تبدأ الخطوات الحاسمة المنبع للتطبيق الفعلي للتحفيز الوع?...

تشكيل فاريكوسيتي، أو تورم/الديكور، على طول محاور عصبية، سمة بارزة من نيوروديجينيريشن التي لوحظت في العديد من الاضطرابات أو إصابات الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك التصلب المتعدد، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، والصدمات الدماغ إصابة1،2. وعلى الرغم من الآثار الفسيولوجية ل varicosities محواري في نشر إمكانيات العمل وانتقال متشابك3، كيف يتم إنشاؤها في فاريكوسيتيس لا يزال غير معروف. في الآونة الأخيرة، استخدام الإنزيم ميكروبيوميتشانيكال المنشأة حديثا في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف من القوارض، وجدنا أن المنبهات الميكانيكية يمكن أن تحدث فاريكوسيتيس في هذه الخلايا العصبية مع فضول ميزات عالية. أولاً، تحريض فاريكوسيتي السريع (< 10 ق) وهذه العملية لا يمكن عكسها بشكل غير متوقع. ثانيا، الشروع في فاريكوسيتي تعتمد على قوة ضغط النفخ: ارتفاع الضغط، والبدء بشكل أسرع. ثالثا، بدء فاريكوسيتي يعتمد على سن الخلايا العصبية. محاور عصبية من الخلايا العصبية الأصغر سنا تظهر أكثر استجابة للضغوط الميكانيكية، مقارنة بتلك الخلايا العصبية القديمة. رابعا، عرض النموذج فاريكوسيتيس على طول محاور عصبية الخلايا العصبية هيبوكامبال، بينما dendrites وشرائح إكسون الأولية من هذه الخلايا العصبية لا تغيير تحت نفس الشرط النفخ. وهكذا كشفت دراستنا سمة رواية من الأقطاب العصبية. هذه النتائج مع النظام في المختبر الناحية الفسيولوجية ذات الصلة. استخدام نموذج في فيفو لإصابات الدماغ الرضية خفيفة (mTBI)، واظهرنا أن varicosities محواري المتقدمة بطريقة تنسيق متعددة في قشرة somatosensory الفئران فورا بعد إغلاق الجمجمة أثر، اتساقا مع جهودنا في المختبر 4من النتائج. من المهم أن نلاحظ أن لدينا المصبوغة والتصوير من الفئران متبي توفر فقط رصاصة المفاجئة من التغييرات الشكلية العصبية، منذ أداء في فيفو الوقت الفاصل بين التصوير مورفولوجيا الخلايا العصبية خلال تأثير ميكانيكية لا تزال غير مجدية.
هذا نظام النفخ السائل أتاح لنا ليس فقط لالتقاط السمات الفريدة المرتبطة بتشكيل فاريكوسيتي الميكانيكية الناجمة عن الإجهاد، ولكن أيضا لتحديد الآلية الأساسية. عن طريق اختبار مختلف الحلول خارج الخلية، محصرات وفتاحات المرشحين مختلف قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي، والكهربية الخلوية، حددنا أن القناة الموجبة المحتملة عابر مستقبلات الفصيلية V الأعضاء 4 (TRPV4) القناة التي يسهل اختراقها إلى Ca2 + و Na+ وتنشيطه بواسطة النفخ المسؤولة أساسا عن الكشف عن الإجهاد الميكانيكية الأولى أثناء تشكيل محواري فاريكوسيتي4. وأكد كذلك مع نهج siRNA خروج المغلوب. أخذت معا، هذا النظام الجديد للمقايسة وقد وضعنا مع ثقافة العصبية هيبوكامبال، هو قيمة للغاية لدراسة خصائص ذبابة الخلايا العصبية المركزية، لا سيما في تركيبة مع تقنيات أخرى.
هذا النظام ذبابة أنشأنا فريد من نوعه ويختلف عن النظم الموجودة سابقا في عدة جوانب رئيسية. أولاً، تجربة الخلايا العصبية في هذا النظام، الخروج من الطائرة الإجهاد الميكانيكية في أشكال الضغط والقص. خلال تأثير الميكانيكية، لا تزال تعلق على السطح ساترة العمليات العصبية ولا تتحرك. وهذا يختلف عن سائر نظم تنطوي أساسا على الانحناء وتمتد في الطائرة التجريبية (أو التوتر)، على سبيل المثال، مثل الانحراف من محاور عصبية المجمعة نقل سلاسل5،6 أو تمتد محاور عصبية نمت في ميكروباتيرنيد القنوات والأغشية المط7،8. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن varicosities محواري يمكن أن يتسبب أيضا في هذه الاختبارات مثل في نظامنا النفخ السائل، بعملية في هذه الإعدادات يأخذ وقتاً أطول بكثير (من 10 دقيقة إلى عدة ساعات6،،من78) ويظهر لا رجعة فيه. وأخيراً، يسمح نظامنا استخدام النفخ السوائل المحلية دراسة السمات المكانية لتشكيل فاريكوسيتي (مثلاً.، dendrites، العمود الفقري الجذعية، سوما، الأجزاء الأولى محواري، محطات محواري)، إلى جانب ميزاته الزمانية. باستخدام هذا النظام، فقد اكتشفنا عدة غير متوقعة وفريدة من نوعها ميزات تكوين محواري فاريكوسيتي، وبخاصة السريعة الحدوث، وعكس بطيئة، وقطبية إكسون-تغصن.
النظام أن نناقش في هذه الورقة متوافق مع العديد من تقنيات جزيئية وخلية علم الأحياء. على سبيل المثال، لدراسة آثار الإجهاد الميكانيكي على مورفولوجيا الخلايا العصبية ودالة، يمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع كوكولتوري المايلين، الوقت الفاصل بين التصوير الرنين الفلورسنت نقل الطاقة (الحنق) وانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF)، تصوير الكالسيوم، وتسجيل المشبك التصحيح. في هذه الورقة، ونحن نركز على العناصر الأساسية للنظام. ثقافة العصبية هيبوكامبال والإعداد النفخ السائل، وتصوير مرور الزمن ذات الدقة العالية للنقل محواري وتصوير الكالسيوم موضحة خطوة بخطوة أدناه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">12 mm coverslips&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">64-0702</td>
			<td style="width:167px;">for 24-well plate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">25 mm coverslips&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-545-102&#160;</td>
			<td>for 6-well plate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rat tail collagen&#160;</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11 179 179 001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10X PBS&#160;</td>
			<td>National Diagnostics&#160;</td>
			<td>CL-253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Na2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">K2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P304-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease enzyme&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEM Earle&#39;s Salts&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Arabinosylcytosine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>147-94-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM media&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>1854313</td>
			<td>transfection reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate rods&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td>PG52151-4</td>
			<td>for puffing pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rubber tubing&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14-169-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic syringe and plunger</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S640-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:341px;">Cell culture dish (35 mm x 10 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">3294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F14201</td>
			<td style="width:167px;">for calcium imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Mito-YFP construct&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Takara Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">for cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">YFP-N1 construct&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Takara Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">for cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Eclipse TE2000-U Mcroscope&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plan Fluor ELWD 20x lens&#160;&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">062933</td>
			<td style="width:167px;">objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Apo TIRF 100x/1.49 oil lens&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01991</td>
			<td style="width:167px;">objective&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microbiomechanical system for studying varicosity formation and recovery in central neuron axons

Varicosities محواري هياكل الموسع على طول مهاوي من محاور عصبية بدرجة عالية من عدم التجانس. أنها موجودة فقط في العقول مع إصابات أو أمراض الأعصاب، بل أيضا في الدماغ العادي. هنا، نحن تصف نظام ذبابة المنشأة حديثا للحث على سرعة وموثوقية وعكسية محواري varicosities، مما يسمح لنا بفهم الآليات التي تحكم تشكيل فاريكوسيتي وتكوين البروتين غير متجانسة. ويمثل هذا النظام وسيلة مبتكرة لتقييم آثار إجهاد القص والضغط على الأقسام المختلفة سوبسيلولار من الخلايا العصبية، تختلف عن الأخرى في المختبر النظم التي تركز أساسا على تأثير تمتد. الأهم من ذلك، ونظرا للخصائص الفريدة لنظامنا، قدمنا مؤخرا اكتشاف رواية تبين أن تطبيق السائل المضغوط يمكن أن يستحث varicosities محواري من خلال تفعيل مستقبلات عابرة قناة المحتملة بسرعة وشكل قابل للعكس. ويمكن استخدام نظامنا النشاط الحيوي مريح في تركيبة مع نضح المخدرات وتصوير الخلايا الحية وتصوير الكالسيوم وتسجيل المشبك التصحيح. ولذلك، يمكن اعتماد هذا الأسلوب لدراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي وتنظيم النقل محواري وديناميات cytoskeleton محواري، الكالسيوم إشارات وإصابة في الدماغ المتصلة بالصدمة التغييرات الشكلية.

قبل النفخ، تظهر محاور عصبية عادة تشكيل فاريكوسيتي قليلاً. النفخ التالية مع ضغط لدينا القياسية (190 mmH2س الارتفاع)، بدء محاور عصبية لتطوير العديد من مثل حبة فاريكوسيتيس. تشكيل فاريكوسيتيس عكسها جزئيا، كما هو موضح بمناطق إكسون تعود إلى حالتها قبل ينفخ بعد فترة استرداد 1...

Watch this Scientific Journal Video about A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons at JoVE.com

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

ويصف هذا البروتوكول نهج السائل المضغوط فسيولوجيا ذات الصلة لتحريض فاريكوسيتيس في الخلايا العصبية السريعة وعكسها.

نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

The overall goal of this pressurized fluid setup is to produce repeatable and consistent swellings along the axons of cultured neurons. This method can help answer key questions in the brain injury field such as the mechanisms behind subcellular morphological changes in neurons following injury. The main advantage of this technique is that the method produces consistent and repeatable morphological changes that recover over time.This is very important technique we developed in the lab. This is because we can not only use the system to identify molecular mechanism governing mechanical-stress-induced axon morphology change as a new form of neuronal plasticity, but also use the system as a screening tool to identify new drugs and the treatment strategy for mild or traumatic brain injury. To begin this procedure, place one or more boxes of 12-millimeter or 25-millimeter coverslips into a glass beaker containing 70%nitric acid, and incubate the coverslips at room temperature overnight.The next day, transfer all coverslips into a four-liter beaker filled with 2.5 liters of double-distilled water. Shake the beaker containing the coverslips for one hour at 100 RPM, and don't forget to use rubber bands to hold the beaker during shaking. Subsequently, transfer the cleaned coverslips to a dry flask with the metal cover.Bake the coverslips in an oven at 225 degrees Celsius for six hours. Then, allow them to cool to room temperature and store them in a sterilized plastic container until usage. Now, place one coverslip into each well of a 24-well plate.Add 30 microliters of coverslip coating solution onto a 12-millimeter coverslip and swirl. Afterward, add one milliliter of sterile PBS to each well. The plate can be either used immediately or stored at four degrees Celsius in sterile PBS for up to one week.On the day of dissection, remove PBS from the plate. Air dry and place the plate under UV light for two to four hours. To dissociate the hippocampal neurons for culture, thaw the protease enzyme solution and pre-warm the plating medium at 37 degrees Celsius.Next, rinse the dissected hippocampus with SLDS. Then, remove it and add two milliliters of protease enzyme solution and incubate the sample at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Afterward, wash the hippocampus explants with five to 10 milliliters of plating medium twice and add five milliliters of plating medium.Dissociate the hippocampal explants into single cells by generating a small vortex using a pipette with a one-milliliter plastic tip. Pipette up and down about 40 times avoiding the formation of oxygen bubbles until the solution becomes cloudy and no large pieces of explant remain. Next, centrifuge the cells at 1, 125 times gravity for three minutes.Remove the supernatant with the cells submerged in medium and re-suspend the cells in 145 milliliters of plating medium. Then, add one milliliter of the cell suspension per well to a 24-well plate. Incubate the cells in the plating medium at 37 degrees Celsius for two to four hours.Afterward, remove the plating medium and replace it with fresh maintenance medium. After two days, replace half of the medium with two micromolar RSC dissolved in maintenance medium to inhibit growth of fibroblast, endothelial and glial cells. Then, after exposing the cells to RSC for two days, replace the medium with fresh maintenance medium.To transfect for the visualization of cell morphology, dilute the construct from stock at one microgram per microliter in Opti-MEM medium and vortex. Then, dilute liposome-mediated transfection reagent in Opti-MEM media and vortex. Subsequently, prepare one construction dilution and one transfection dilution for each well.Next, prepare a one-to-one mixture of the construct and Opti-MEM medium and transfection reagent and Opti-MEM medium and vortex. Incubate the mixture at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, remove half of the medium from each well and transfer this medium into a clean conical tube.Keep the tube in the incubator, then add 100 microliters of the mixture prepared in the previous step to the remaining medium in the well. Allow the cells to incubate at 37 degrees Celsius for 20 to 30 minutes. During incubation, add one volume of fresh maintenance medium to the medium in the conical tube and place the mixture in the same incubator.Following incubation, remove the mediums containing the transfection solution from the wells and replace it with the one-to-one mixture of old and fresh maintenance medium in the conical tube. In this procedure, insert the pipette into the screw top of the micromanipulator to hold it into place. Screw the metal flat-top screw attached to the micromanipulator arm so that it holds the unpulled end of the pipette just above where the rubber tubing is attached.Angle the pipette at a 45 degree angle with the surface of the neuron containing coverslips. Turn on the florescence filter. Open the aperture, and ensure a fluorescent spot can be seen coming through the objective.Using the micromanipulator, move the pipette into a position that lines up the tip with the fluorescent spot and lower the pipette into a position just above the height of the cell culture dish. Once it is in position, turn on the transmitted light and turn off the florescence. Using tweezers, transfer one coverslip with the cells facing toward the pipette from the cell culture plate to the cell culture dish containing 2 milliliters of Hank's buffer at room temperature.Using the fine focus knob and 20 fold objective, focus on a plane about four full turns above the cells. Subsequently, use the micromanipulator to position the pipette tip so that it is focused and in the center left-hand side of the plane as seen through the eyepieces. Once the pipette is in position, focus the microscope on a plane that contains the region of interest.In the imaging of seven div, GFP transfected mouse hippocampal neurons showed an axon pre and post puffing, as well as a following 10 minute recovery period. Here is the Kymograph of time-lapse imaging of the same neuron. Red arrows indicate the varicosities that have formed to following 150 seconds of 190 milliliter H2O puffing, beginning at 30 seconds.Once mastered, this technique can be done in three hours if it is performed properly. Following this procedure, other methods like whole cell recording, time-lapse FRET and TIRF imaging, and calcium imaging can be performed in order to answer additional questions like the impacts of mechanical stress on neural and electrical and calcium signaling, protein trafficking and interactions. After its development, this technique paved the way for researchers in the photo traumatic brain injury to explain molecular mechanisms underlying axonal varicosity formation in living neurons.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform the experiments to study mechanosensations of central neurons.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

النظامية والمحلية تسليم المخدرات لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي في المجموعات القوارض

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

العصب البصري Transection : نموذج من موت الخلايا المبرمج الخلية العصبية الكبار في الجهاز العصبي المركزي

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

خفيفة الوزن، القائم على نظام سماعات لمعالجة ملاحظات السمعية في العصافير

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية<em&gt; في فيفو</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...