Name: high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method at JoVE.com

بتأييد هذا العمل بمنحه بدء تشغيل من إدارة علم الأمراض، جامعة ولاية يوتا إلى J.C.S.B.

1. تحديد التآزر التنبؤ بطفرات من Dataset الكيميائية-علم الوراثة بواسطة الأسلوب2 التداخل (O2M)
ملاحظة: هذا هو الأسلوب لتحديد التآزر طفرات التنبؤ باستخدام مجموعة البيانات المنشورة من نيكولز وآخرون. 17 في كولاي. ومع ذلك، يمكن أن يتم ذلك في أي مجموعة ?...

<ol>
	<li>Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antimicrobial+Resistance+Crisis:+Causes,+Consequences,+and+Management.">The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management.</a> Front Public Health. 2, 145 (2014).</li><li>Butts, A., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Discovery:+Something+Old+and+Something+New.">Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New.</a> PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).</li><li>Roemer, T., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Development:+Challenges,+Unmet+Clinical+Needs,+and+New+Approaches.">Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).</li><li>Oprea, T. I., Mestres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Repurposing:+Far+Beyond+New+Targets+for+Old+Drugs.">Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs.</a> AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).</li><li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., Garc&#237;a-Contreras, S. J., Garc&#237;a-Contreras, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+repurposing+as+an+alternative+for+the+treatment+of+recalcitrant+bacterial+infections.">Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections.</a> Front Microbiol. 6, 282 (2015).</li><li>Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Drug+Synergy+in+Antimicrobial+Treatments.">Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments.</a> PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).</li><li>Cowen, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Hsp90+function+as+a+powerful,+broadly+effective+therapeutic+strategy+for+fungal+infectious+disease.">Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease.</a> P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).</li><li>Zuo, G. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Antibacterial+and+Antibiotic+Effects+of+Bisbenzylisoquinoline+Alkaloids+on+Clinical+Isolates+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+Aureus+(MRSA).">Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> Molecules. 16 (12), 9819 (2011).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+drug+combinations:+interaction+and+network+perspectives.">Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).</li><li>Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+and+rational+design+of+synergistic+small-molecule+pairs+for+combating+and+bypassing+antibiotic+resistance.">High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance.</a> PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).</li><li>Brown, J. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biology+of+a+fungal+meningitis+pathogen+using+chemical+genetics.">Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics.</a> Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).</li><li>Cokol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+synergistic+drug+pairs.">Systematic exploration of synergistic drug pairs.</a> Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).</li><li>Borisy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+multicomponent+therapeutics.">Systematic discovery of multicomponent therapeutics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).</li><li>Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?+The+Saariselk&#228;+agreement+revisited.">What is synergy? The Saariselk&#228; agreement revisited.</a> Front Pharmacol. 6, 181 (2015).</li><li>Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+assessed+by+checkerboard.+A+critical+analysis.">Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Landscape+of+a+Bacterial+Cell.">Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell.</a> Cell. 144 (1), 143-156 (2011).</li><li>Chandrasekaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).</li><li>Pradhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling+of+Plasmodium+falciparum+as+a+tool+to+aid+antimalarial+drug+discovery.">Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery.</a> Sci Rep. 5, 15930 (2015).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy.">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).</li><li>Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Hsp90+Genetic+Interaction+Network+in+Candida+albicans+Reveals+Environmental+Contingency+and+Rewired+Circuitry.">Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry.</a> PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).</li><li>Robbins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Antifungal+Combination+Matrix+Identifies+a+Rich+Pool+of+Adjuvant+Molecules+that+Enhance+Drug+Activity+Against+Diverse+Fungal+Pathogens.">An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens.</a> Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).</li><li>Wildenhain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Synergism+from+Chemical-Genetic+Interactions+by+Machine+Learning.">Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning.</a> Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).</li><li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole.">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li></ol>

أزواج جزيء صغير التآزر يمكن أن تكون أداة قوية في علاج العدوى الميكروبية، إلا أنهم لم يبلغوا إمكاناتهم الكاملة السريرية نظراً لأزواج التآزري تحديا لتحديد. وتصف هذه الورقة أسلوباً لتحديد أزواج التآزري أسرع بكثير من تركيبات عشوائية بسيطة. باستخدام مجموعات البيانات الكيميائية-علم الوراثة، ...

البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية تسبب التهابات أكثر من 2 مليون و 23,000 حالة وفاة سنوياً في الولايات المتحدة وفقا لمركز السيطرة على الأمراض1. وتلزم علاجات جديدة للتغلب على هذه الالتهابات. وتشمل استراتيجيات لتحديد هذه العلاجات الجديدة تطوير أدوية جديدة مضادة للميكروبات أو repurposing الجزيئات الصغيرة التي وافقت على الشروط الأخرى لعلاج العدوى الميكروبية2،،من34. ومع ذلك، يتم اكتشاف الأدوية الجديدة باهظة التكاليف وتستغرق وقتاً طويلاً. Repurposing المخدرات قد لا تحدد الرواية العقاقير أو المخدرات يستهدف5،6. لدينا مختبر يركز على استراتيجية ثالثة المعروفة بالعلاجات المركبة تآزرية. تركيبات التآزري تحدث عندما يكون اثنين من الجزيئات الصغيرة معا فعالية أكبر من تأثير المضافة على حدة بلغت7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون تركيبات التآزر فعالة ضد مقاومة الممرض إلى واحدة من الجزيئات الصغيرة في زوج بالإضافة إلى وجود أقل آثار خارج الهدف غير مرغوب فيها، مما يجعلها كبيرة محتملة8،9، 10.
أزواج التآزري نادرة، تحدث في 4-10% تقريبا من المخدرات تركيبات11،،من1213. وهكذا، التقنيات التقليدية مثل شاشات العشوائية صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً، مع آلاف تركيبات المحتملة من مكتبة صغيرة من الجزيئات مائة. وعلاوة على ذلك، تفاعلات تآزرية عادة لا يمكن التنبؤ من نشاط مركبات14. غير أن المؤلفين وضع نهج الفائق إلى الشاشة لأزواج تآزرية، يسمى التداخل2 الأسلوب (O2M)12. يسمح هذا الأسلوب, الموضحة هنا، لتحديد الهوية أسرع وأكثر كفاءة من هذه الأزواج المتآزر. O2M يتطلب استخدام زوج تآزري معروفة ومجموعة بيانات الكيميائية-علم الوراثة. يتم إنشاء مجموعات البيانات الكيميائية-علم الوراثة عند مكتبة طفرات خروج المغلوب يزرع حضور العديد من الجزيئات الصغيرة المختلفة. إذا كان جزيء واحد في زوج تآزري معروفة الحث نفس النمط الظاهري من متحولة خروج المغلوب خاصة كجزيء التآزري الثانية، أي جزيء الصغيرة الأخرى الذي يتسبب النمط الظاهري من هذا المسخ نفسه ينبغي أيضا التآزر مع كل الأعضاء المعروفة زوج تآزرية. وقد استخدمت هذا الأساس المنطقي في مختبر براون تحديد أزواج المضادات الحيوية تآزري فعال ضد الإشريكيّة القولونية () وأزواج العقاقير المضادة للفطور تآزري فعال ضد الفطريات المسببة للمرض بين المرسلة (جيم المرسلة)11،12. O2M ليست قابلة للتكيف لمسببات الأمراض المختلفة فحسب، ولكن يسمح لفحص مكتبات كبيرة من الجزيئات لتحديد أزواج التآزر بسهولة وسرعة. الفرز مع المسخ الوراثية التي حددتها O2M يسمح لنا بالتحقق من صحة تلك الجزيئات الصغيرة وتوقع للتآزر. وهكذا، اختبار مكتبة جزيء 2,000 بيرويس سيستغرق شهرا، بينما إذا كان هناك فقط 20 الجزيئات في تلك المكتبة وتوقع للتآزر، اختبار للتآزر الآن يستغرق بضعة أيام. O2M لا تتطلب مهارات البرمجة، والمعدات المطلوبة متوفرة في معظم مختبرات أو المرافق الأساسية. بالإضافة إلى الباحثين المهتمين في تركيبات العقاقير، تحليل O2M لمصلحة أي شخص الذين قد أكملت شاشة المخدرات ويريد توسيع يضرب بهم عن طريق تحديد التفاعلات الهامة للمخدرات-المخدرات. أدناه هو بروتوكول لتحديد الجزيئات الصغيرة تآزرية في البكتيريا، فضلا عن التحقق من صحة التفاعلات التآزر المتوقعة في فحوصات معروفة15،16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

على الرغم من أن العقاقير المضادة للميكروبات أدى إلى زيادة العمر ونوعية الحياة في القرنال 20، ومقاومة مضادات الميكروبات يهدد مجتمعنا كامل القدرة على علاج العدوى الجهازية. في الولايات المتحدة وحدها، العدوى المقاومة للمضادات الحيوية تقتل ما يقرب من 23 ألف شخص في السنة وتكلفة حوالي 20 بیلیون دولاراً في الرعاية الصحية الإضافية. نهج واحد لمكافحة مقاومة مضادات الميكروبات هو الجمع بين العلاج، ومفيدة بشكل خاص في هذه المرحلة المبكرة الحاسمة من العدوى، قبل إصابة الكائن الحي وصورتها مقاومة المخدرات التي جرى تحديدها. العديد من العلاجات المضادة للميكروبات استخدام العلاجات المركبة. ومع ذلك، معظم هذه التشكيلات قابلة للإضافة، بمعنى أن كفاءة مجتمعة هو نفسه كمجموع لفعالية المضادات الحيوية الفردية. بعض العلاجات المركبة التآزر: كفاءة مجتمعة أكبر بكثير من المواد المضافة. مجموعات تعاونية مفيدة بشكل خاص نظراً لأنها يمكن أن تعوق نمو سلالات مقاومة للعقاقير المضادة للميكروبات. ومع ذلك، هذه التركيبات نادرة ويصعب تحديد. وهذا سبب العدد الضخم من الجزيئات اللازمة لفحصها بطريقة عشوائية: وقد مكتبة 1,000 الجزيئات التوليفات المحتملة 1 مليون. وهكذا، بذلت جهود للتنبؤ بالجزيئات للتآزر. توضح هذه المقالة طريقة الفائق للتنبؤ بأزواج جزيء صغير التآزري المعروفة بتداخل2 الأسلوب (O2M). O2M يستخدم أنماط من مجموعات البيانات الجينية الكيميائية لتحديد طفرات التي شديدة الحساسية لكل جزيء في زوج تآزري ولكن ليس للجزيئات الأخرى. مختبر براون يستغل هذا الاختلاف النمو قبل أداء شاشة الفائق للجزيئات التي تحول دون نمو المسخ ولكن الخلايا لا البرية من نوع. جزيئات العمل سبق تحديدها في المختبر التآزر مع ميثوبريم المضادات الحيوية والفلوكونازول العقاقير المضادة للفطور باستخدام هذه الاستراتيجية. وهنا الكتاب الحالي طريقة إلى الشاشة لتركيبات التآزري الرواية، الذي يمكن تغييره للعديد من الكائنات الحية الدقيقة.

فحوصات رقعة الداما طريقة شبه كمي لقياس التفاعلات تآزرية. يحدد فيسي، والنتيجة النهائية الإخراج، إذا كان الجمع بين المخدرات يعتبر التآزري (فيسي ≤0.5)، غير-التفاعل (0.5 < فيسي < 4)، أو معادية (فيسي ≥4.0). ويبين الشكل 1 كيفية إعداد التدرجات المخدرات في مقايسة رقعة ال...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method at JoVE.com

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

تركيبات المخدرات التآزري صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً لتحديد تجريبيا. هنا، نحن تصف أسلوب لتحديد والتحقق من صحة التآزري الجزيئات الصغيرة.

تحديد تركيبات المخدرات التآزر بواسطة الأسلوب2 تداخل الفائق

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The overall goal of this methodology is to identify the synergistic molecules, which amplify each others activity, when combined through High-throughput screening. Synergistic drug pairs are a promising strategy, for combating drug resistant infections but they are difficult to identify. This method can identify molecules that interact with existing antimicrobial drugs used to treat infectious diseases.In the long term these combinations, can enter preclinical assessment and eventually improve patient care. The main advantage of this technique is that it can be done with any organism of interest and with any with any library of small molecules. The implications of this technique, extend towards therapy of multiple infectious diseases as it works with any organism of interest.Use a standard spreadsheet to calculate the mean growth score and standard deviation for all the mutants, in the presence of a particular concentration of the small molecule added. Then, calculate the Z scores for each of the small molecule concentration. Then, highlight the gene mutants with significant Z scores.First, grow an E.coli culture in M9 minimal medium, for overnight at 37 degrees Celsius. Then, dissolve the small molecules in dimethyl sulphoxide at a high concentration above 10 milligrams per milliliter. Next, add 100 microliters of M9 medium to each well in a 96 well plate.Pipette an additional 100 microliters of M9 medium in column one such that the volume in that column is 200 microliters. Then, add approximately 10 microliters of the concentrated small molecule solution, in the column one. After adding the small molecules, start diluting it across the X axis of the plate.Continue diluting till there is, 100 microliters in column 11. After mixing column 11, discard 100 microliters from that column. Let there be only medium in column 12 to normalize the data.Next, record the optical density value at 600 nanometers of the overnight culture grown in M9 minimal medium. Then, add two microliters of the culture into each well. Such that there are 1000 cells per well.Then, shake the plate gently. And note the optical density reading at 600 nanometers for zero hour time point. Once the reading is recorded, incubate the plate at 37 degrees Celsius for a day.Again, measure the optical density value at 600 nanometers for 24 hour time point. To perform the checkerboard assay, grow an E.coli culture in M9 minimal medium for overnight at 37 degrees Celsius. Then, add 100 microliters of M9 medium to each well and add an extra 100 microliters of the same medium in column one of a 96 well plate.Next, add the tests small molecules, in each well in column one. And add double the concentration in well A1.Then, create a dilution gradient along the X axis by transferring 100 microliters, from column one to column two. Continue the dilution process, until 100 microliters is added in column 11.After mixing column 11, discard 100 microliters from that column and leave column 12 with only medium without any drugs. Create another gradient for the second drug dilution. To do this, add 100 microliters of the medium containing two X, minimal inhibitory concentration of the input molecule in row A.Then, transfer 100 microliters from row A to B.Continue the dilution process, until 100 microliters is added in row G.After mixing row G, discard 100 microliters from the well.Then inoculate the plate with two microliters of the culture into each well. Such that there are 1000 cells per well. Then, measure the optical density reading at 600 nanometers for zero hour time point.Once the reading is recorded, incubate the plate at 37 degrees Celsius for 24 hours. And then, measure the optical density value at 600 nanometers for 24 hour time point. To conduct High-throughput screening, for synergistic drugs, culture both wild type and synergy prediction mutant cells in M9 minimal medium.Then, add the drugs from the library to the medium. Next, inoculate one plate of library drugs with the wild type and one other plate with synergy prediction mutant bacteria. This plate represents the checkerboard assay used to investigate synergistic drug combinations.In this plate, well F9 with the lowest FICI score of 0.07 indicates that the small molecule pair is synergistic. This plate represents the checkerboard assay to investigate non interacting drug combination. In this plate, the well C3 with the lowest FICI score of 1.0 indicates that the small molecule pair, does not interact with each other.This plate represent the checkerboard assay used to investigate antagonistic drug combinations. In this plate, well A1 with the lowest FICI score of 8.0 indicates that the interaction between, the drug molecules is antagonistic. Next Befeldin A, a small molecule drug in Fluconazole, is used to study the growth of C and U Formins.The plot shows that the growth of both the wild type and the synergy prediction mutant is inhibited slightly and to the same extent. This indicates that Befeldin A and Fluconazole are non-synergistic drug partners. On the contrary, the growth of synergy prediction mutant of C and U Formins is inhibited significantly, in the presence of Refromisyn and Fluconazole.Indicating that the drugs are synergistic partners. Interestingly, the wild type growth is not inhibited at all. Here, the greatest growth difference is observed, between 32 and 49 hours post inoculation.Once mastered, this technique can shorten the time to identify synergistic drug interactions. While carrying out this procedure, it's important to remember not to combine drugs in the last column in the last row of the checkerboard assay. Following this procedure, other methods of synergistic molecule identification, can be performed in order to identify additional synergistic drug interactions.After watching this video, you should have a good understanding of how to use the O2M methodology to identify putative synergy markers in order to find synergistic drug interactions with your organism of interest. Don't forget that while working with some small molecules can be hazardous and any precautions in the MSDS, should be followed while performing this protocol.

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في<em&gt; كلاميدوموناس reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: عالية إنتاجية على أساس تسلسل تقنية لتحديد تكرار متأخر مناطق الجينوم

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...